盧富山，尹清強，趙衛(wèi)衛(wèi)， 王 瀟

（1.河南普愛飼料股份有限公司，河南周口466100；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002）

玉米在我國畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用，是斷奶仔豬日糧中的重要能量原料，占日糧總質(zhì)量的60%以上。但由于仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，消化酶尤其是淀粉酶分泌不足，使得仔豬腸道對淀粉利用率很低（王富盛等，2012；王艷玲等，2005），目前飼料企業(yè)多使用膨化處理和細(xì)粉碎來提高玉米淀粉消化率，但是膨化處理會使玉米中的必需氨基酸含量減少（Amornthewaphat等，2005），細(xì)粉碎會加重豬胃腸角質(zhì)化和損害的程度（Wondra，1995）。發(fā)酵是加工谷物類食品的傳統(tǒng)方法，經(jīng)微生物發(fā)酵作用可改變產(chǎn)品的組成結(jié)構(gòu)、改善產(chǎn)品的風(fēng)味和口感、提高產(chǎn)品的安全性和營養(yǎng)價值（劉慶艾等，2015；Dirar等，2010）

研究表明，淀粉經(jīng)微生物發(fā)酵和酶解，產(chǎn)物糊精能被仔豬有效利用 （劉曉峰等，2011）。Lee等（2000）在比較糊精、玉米淀粉、葡萄糖等對21日齡斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響時，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉對仔豬的平均日增重、平均日采食量的影響顯著低于其他各組。閆雅婷等（2011）利用發(fā)酵法對玉米粉營養(yǎng)結(jié)構(gòu)進行改性，可溶性糖含量提高171.9%，改善了玉米的飼用品質(zhì)。另外，加入乳酸菌和酵母菌的混合發(fā)酵玉米可以產(chǎn)生有機酸和抗菌物質(zhì)，口感更加香甜。

本試驗旨在利用復(fù)合微生物配合酶解工藝，摸索出微生物發(fā)酵最優(yōu)條件以及發(fā)酵后可溶性糖的變化，為發(fā)酵谷物飼料提供應(yīng)用依據(jù)，從而提高玉米在幼齡動物飼養(yǎng)中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及屎腸球菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號分別為 CICC20819、CICC1355、CICC6078。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉 0.5 g，水 100 mL，pH 7.0。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖 2 g，酵母粉1 g，胰蛋白胨 2 g，水 100 mL。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖 2 g，胰蛋白胨1 g，牛肉蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，結(jié)晶乙酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，檸檬酸三銨0.2 g，結(jié)晶硫酸鎂0.05 g，硫酸錳0.02 g，吐溫80 0.1 mL，水 100 mL。

1.1.3 試劑與設(shè)備 試劑包括蒽酮、乙酸乙酯、濃硫酸、氫氧化鈉、福林、DNS、碘液等。設(shè)備包括滅菌鍋、離心機、分光光度計、搖床、超凈臺、三角瓶等。

1.1.4 材料 玉米粉，過60目篩備用。高溫淀粉酶（SUKAMy-Hi PW4）購于蘇柯漢生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測指標(biāo)及方法 可溶性糖的測定：蒽酮法；粗蛋白質(zhì)的測定：凱式定氮法；總酸測定方法：氫氧化鈉滴定法；活菌數(shù)的測定：平板涂布法。

1.2.2 最佳接種量的優(yōu)化 設(shè)定對枯草芽孢桿菌、酵母菌、屎腸球菌3個條件進行優(yōu)化，每個條件設(shè)計3個水平采用正交試驗，按L9（33）設(shè)計復(fù)合菌發(fā)酵接種量正交試驗（見表1）。以玉米粉為發(fā)酵基質(zhì)，料水比 1∶0.45，100 ℃滅菌 20 min，發(fā)酵48 h，以發(fā)酵后可溶性糖的含量、總酸為檢測指標(biāo)，綜合確定混菌發(fā)酵各菌的最佳接種比例。

表1 復(fù)合菌發(fā)酵最佳接種量的優(yōu)化正交試驗因素水平表

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化 在復(fù)合菌發(fā)酵接種比例優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗按L9（33）設(shè)計對混菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化（見表2）。

表2 復(fù)合菌發(fā)酵條件的優(yōu)化正交試驗因素水平表

1.2.4 外源淀粉酶對發(fā)酵效果的影響 以玉米粉為培養(yǎng)基質(zhì)，100℃高溫滅菌20 min，自然pH，料水比 1∶0.45，高溫 α-淀粉酶添加量為 10、20、30 U/g玉米粉。每組3個重復(fù)，35℃培養(yǎng)48 h，樣品在65℃烘箱中烘干，粉碎過60目篩，檢測可溶性糖的含量。

1.2.5 微生物發(fā)酵與酶解結(jié)合對可溶性糖的影響首先對玉米粉采用100℃滅菌 20 min，在上述最佳發(fā)酵條件（72 h、35 ℃、料水比為 1∶0.55）及酶解（10 U/g玉米粉）的基礎(chǔ)上，設(shè)計3個試驗組。

試驗組1：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及屎腸球菌的接種量分別為5%、7%和9%；試驗組2：添加高溫α-淀粉酶10 U/g玉米粉；試驗組3：滅菌前添加高溫α-淀粉酶10 U/g玉米粉，混合滅菌后再接種微生物發(fā)酵。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵玉米粉的最佳益生菌配比 由表3的極差分析得知，屎腸球菌對發(fā)酵后總酸的影響最大，以總酸為檢測指標(biāo)，正交表中給出的最優(yōu)效果為A1B2C3，即：枯草芽孢桿菌接種量5%、釀酒酵母接種量7%、屎腸球菌接種量為9%。表4的極差分析結(jié)果表明，對可溶性糖含量影響最大的是釀酒酵母，正交表給出的最優(yōu)組合為A1B2C1，即：枯草芽孢桿菌接種量5%、釀酒酵母接種量7%、屎腸球菌接種量為5%。根據(jù)正交試驗結(jié)果，得出幾組 較 好 組 合 ， 分 別 為 A3B1C3、A1B2C3、A1B2C2、A1B2C1，并進行重復(fù)試驗驗證。發(fā)現(xiàn)A1B2C3組產(chǎn)糖量最高，即枯草芽孢桿菌接種量5%、釀酒酵母接種量7%、屎腸球菌接種量為9%為最佳試驗方案（見表 5）。

表3 復(fù)合菌發(fā)酵玉米粉產(chǎn)酸的最佳接種量

2.2 復(fù)合發(fā)酵條件優(yōu)化試驗結(jié)果 從表6的極差可以看出，產(chǎn)生可溶性糖的最優(yōu)組合發(fā)酵條件為：72 h、35 ℃、料水比為 1∶0.55。對可溶性糖含量的影響因素主要是發(fā)酵時間，其次為水分，而溫度影響最小。表7的結(jié)果分析表明，對總酸的影響因素依次為：溫度＞時間＞水分，最佳發(fā)酵條件為60 h、35 ℃、料水比為 1∶0.55。但在此條件下，可溶性糖含量卻只有39.7%。

表4 復(fù)合菌發(fā)酵玉米粉產(chǎn)可溶性糖的最佳接種量

表5 正交試驗結(jié)果的驗證

根據(jù)正交試驗結(jié)果，得出最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵 72 h、發(fā)酵溫度 35℃、料水比為 1∶0.55，經(jīng)驗證在該條件下發(fā)酵產(chǎn)物可溶性糖含量達到48.6%，總酸含量能達到1.52%。整個發(fā)酵過程分為好氧和厭氧2步，發(fā)酵初期枯草芽孢桿菌大量繁殖分泌大量的酶和消耗大量氧氣為乳酸菌和酵母菌提供了繁殖基礎(chǔ)。發(fā)酵中后期對糖含量及酸度影響較大的屎腸球菌在厭氧條件下又進行了大量的增殖，起始溫度縮短了菌種生長的靜止期，能迅速地適應(yīng)環(huán)境并進行增殖代謝，同時隨著環(huán)境中溫度的升高導(dǎo)致釀酒酵母部分死亡裂解，使細(xì)胞中的糖類釋放到周圍環(huán)境中。

2.3 淀粉酶與微生物復(fù)合對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.3.1 不同淀粉酶劑量對可溶性糖含量的影響從表8可以看出，添加量在10～20 U/g玉米粉時，可溶性糖含量隨著高溫α-淀粉酶的添加量增加而降低，在20～30 U/g玉米粉時，可溶性糖含量隨著α-淀粉酶的添加量增加而升高。從經(jīng)濟效益角度分析，α-淀粉酶添加量選為10 U/g玉米粉。

表6 復(fù)合發(fā)酵條件對可溶性糖產(chǎn)量的影響

表7 復(fù)合發(fā)酵條件對酸產(chǎn)量的影響

表8 高溫α-淀粉酶添加量對可溶性糖含量的影響

2.3.2 微生物發(fā)酵與酶解結(jié)合對可溶性糖產(chǎn)量的影響 由表9可以看出，單獨的純微生物發(fā)酵和純酶解，分別使可溶性糖含量分別由對照組的11.5%提高到32.3%和37.8%；而當(dāng)微生物發(fā)酵和酶解相結(jié)合時，可使可溶性糖含量提高到61.2%。

表9 外源淀粉酶結(jié)合微生物發(fā)酵的效果

3 討論

微生物發(fā)酵與生物酶解相結(jié)合，彌補了微生物發(fā)酵產(chǎn)酶量低，生物酶解酶系單一的缺點，使得發(fā)酵更加徹底，極大提高了玉米的消化率，同時保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。同時酵母和乳酸菌的發(fā)酵可產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸等風(fēng)味物質(zhì)以及未知生長因子，對動物有一定的誘食性和促生長作用。

根據(jù)正交試驗結(jié)果，分別對試驗得出的4種組合方案進行正交試驗，發(fā)現(xiàn)與A1B2C3組相比，A3B1C3組由于影響糖含量因素最大的酵母接種量較少，而且枯草芽孢桿菌接種量過大與酵母形成一定的競爭關(guān)系，導(dǎo)致酵母不能更好地生長，使可溶性糖含量降低；A1B2C2組與A1B2C1組，由于屎腸球菌接種量較少，在發(fā)酵中后期增殖較慢，未能迅速改變環(huán)境的pH，抑制枯草芽孢桿菌的生長，從而促進釀酒酵母的生長導(dǎo)致糖含量降低。所以確定最優(yōu)組為A1B2C3，即枯草芽孢桿菌接種量5%、釀酒酵母接種量7%、屎腸球菌接種量為9%為最佳試驗方案。

根據(jù)高溫淀粉酶最適溫度為90℃左右，且耐受100℃高溫，結(jié)合滅菌和冷卻過程，在一定程度上能發(fā)揮高溫淀粉酶的活性，故在滅菌前添加10 U/g玉米粉的高溫α-淀粉酶。微生物發(fā)酵結(jié)合酶解工藝，不僅將玉米淀粉絕大部分分解，為微生物生長提供必要的碳源，也利用了單純滅菌在升溫與降溫過程中產(chǎn)生的能量。

4 結(jié)論

本研究確定了固態(tài)發(fā)酵玉米粉的最佳培養(yǎng)條件與發(fā)酵工藝條件，使玉米粉中的可溶性糖含量由原來的11.5%提高到32.3%，漲幅達到了181%，進一步與生物酶解工藝相結(jié)合，使可溶性糖含量又提高了89%以上，總酸含量達到了1.5%。