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(1.西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院， 昆明 650201； 3.金平慧達(dá)農(nóng)林開發(fā)有限公司， 云南 紅河 661500)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)為百合科黃精屬多年生草本植物，藥用歷史有兩千多年，俗稱姜形黃精，同時(shí)還具有食用性。李時(shí)珍曰:“黃精為服食要藥”,體現(xiàn)其藥食兩用性[1]。多花黃精以黃精多糖、甾體皂苷為主要有效成分[2]，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益腎填精、生津補(bǔ)脾等功效[3-5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃精有降血糖、血脂、血壓和抗衰老的作用，對(duì)治療心血管疾病、糖尿病等方面也有較好效果[6-7]。中國(guó)該屬植物有30多種。多花黃精主產(chǎn)于四川、湖南、云南等省，是中國(guó)的特有植物。

種子休眠是植物種子對(duì)外界環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制[8]，很多學(xué)者對(duì)種子休眠原因及打破種子休眠的方法進(jìn)行了大量的研究[9-16]。發(fā)現(xiàn)種子休眠的類型及原因包括兩大類:第一類是胚本身的因素導(dǎo)致的。包括胚發(fā)育未完成；生理上沒(méi)成熟；缺少必須的激素或者抑制種子萌發(fā)物質(zhì)的存在。種子需要通過(guò)后熟過(guò)程，完成一系列生理生化變化后才能萌發(fā)。第二類是外源因素導(dǎo)致的，即胚以外的各種組織導(dǎo)致休眠，比如種殼產(chǎn)生的機(jī)械阻礙或存在抑制物，種子不透水、不透氣等[17-20]。

黃精種子具有休眠現(xiàn)象，研究表明黃精種子休眠屬于胚本身原因引起的休眠，即種胚有一個(gè)后熟期，也可能是種胚內(nèi)內(nèi)源激素GA和CK相對(duì)較少，種子處于休眠狀態(tài)，即使有適宜的環(huán)境條件種子仍不能萌發(fā)。導(dǎo)致黃精種子休眠的原因包括胚的后熟以及種子結(jié)構(gòu)。

張躍進(jìn)等研究表明黃精種子屬于綜合休眠。多花黃精與黃精同為黃精屬，其形態(tài)特征和內(nèi)環(huán)境等都具有相似性，因此都具有休眠性，發(fā)芽率較低。多花黃精單獨(dú)作為一個(gè)種，但關(guān)于多花黃精種子繁殖技術(shù)的報(bào)道較少。張旺凡[21]和趙致等[22]分別利用適宜濃度的外源6-BA和GA3處理和低溫貯藏的方法來(lái)打破多花黃精種子休眠，都得到較好的發(fā)芽效果。劉保才將多花黃精種子在不同條件下貯藏，發(fā)現(xiàn)在低溫和常溫下層積種子打破休眠效果較好[23]。周建金等為打破黃精種子休眠、提高種子發(fā)芽率，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)多花黃精種子進(jìn)行不同濃度GA3處理和不同時(shí)間的低溫貯藏處理[24]。張旺凡認(rèn)為，多花黃精種子休眠屬于胚本身原因引起的休眠，即種胚有一個(gè)后熟期[21]。

多花黃精種子具有休眠性，發(fā)芽率低，使得多花黃精資源開發(fā)利用、人工育種栽培遇到困難。所以本研究探討了層積后熟過(guò)程中多花黃精種子生理生化的變化，通過(guò)測(cè)定多花黃精種子后熟過(guò)程中內(nèi)源激素及關(guān)鍵酶活性的變化,明確胚發(fā)育與內(nèi)源激素及呼吸途徑關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,為實(shí)際生產(chǎn)中采用生化手段調(diào)控胚休眠,及促進(jìn)后熟提供理論指導(dǎo)，完善多花黃精種子休眠機(jī)制理論。同時(shí)為多花黃精種苗育種及資源更合理的利用提供便利。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

種子采自云南省金平縣大老塘種植基地的二年生多花黃精植株，經(jīng)鑒定為百合科植物多花黃精的果實(shí)和種子。采收果實(shí)后密封1周揉搓去掉果皮，洗凈獲得多花黃精種子，用濾紙吸干外表水分備用。實(shí)驗(yàn)在西南生物多樣性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多花黃精種子后熟期間生理生化指標(biāo)測(cè)定

以干燥貯藏的種子(袋裝自然存放)為對(duì)照，將種子按20 ℃層積、20 ℃與4 ℃(每24 h交替1次)交替層積、4 ℃層積、-20 ℃層積4種方法處理(將種子與濕砂按體積1∶5層積，河砂濕度手捏剛出水而不落，定期噴水保濕)。以后每10 d測(cè)定不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間的下列各項(xiàng)指標(biāo)，各項(xiàng)測(cè)定均重復(fù)3次。

種子激素測(cè)定方法：脫落酸含量、赤霉素含量、細(xì)胞分裂素含量、生長(zhǎng)素含量采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測(cè)定。

1.2.2 多花黃精種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

以干燥貯藏種子為對(duì)照，將種子按20 ℃層積、20 ℃與4 ℃(每24 h交替1次)交替層積、4 ℃層積、-20 ℃層積4種方法處理，貯藏70 d后進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

萌發(fā)前，種子先于20 ℃培養(yǎng)箱清水浸泡24 h，再播種于內(nèi)徑為15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)放3層濾紙，蒸餾水培養(yǎng)， 25 ℃黑暗條件下智能人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理均重復(fù)3次，每重復(fù)50粒種子。以種胚突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)，間隔20 d統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽數(shù)，共統(tǒng)計(jì)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件下種子萌發(fā)情況

多花黃精種子具有休眠特性，需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的層積處理完成后熟才能萌發(fā)。作為對(duì)照，在干燥貯藏條件下，多花黃精種子層積50 d后生活力完全喪失，種子失去發(fā)芽力。與對(duì)照相比，層積70 d后，4 ℃層積、交替層積和20 ℃層積這3種貯藏條件下多花黃精種子的生活力分別為72.33%、70.67%和 70.67%，將不同貯藏條件下的種子分別置于25 ℃黑暗條件并給予一定水分之后，20 d后種子陸續(xù)開始萌發(fā)，萌發(fā)率分別為62%、59%和55%，4 ℃條件下萌發(fā)率最高；而-20 ℃貯藏條件下的種子，層積70 d后，種子生活力降為0，將種子置于25 ℃并給予一定水分之后，未能萌發(fā)。

表1 不同貯藏條件下種子生活力和發(fā)芽率

貯藏條件生活力(層積70d后)(%)發(fā)芽率(%)干燥貯藏0020℃層積70.6755交替層積70.67594℃層積72.3362-20℃層積00

2.2 不同貯藏條件下種子內(nèi)源激素含量的變化

GA更多的被認(rèn)為是促進(jìn)種子解除休眠的必要因子，GA主要通過(guò)2種途徑來(lái)促進(jìn)種子解除休眠: 1) 動(dòng)員種子內(nèi)的貯藏物質(zhì),刺激胚的生長(zhǎng); 2) 増強(qiáng)軟化屏障組織水解酶的表達(dá),降低根尖的機(jī)械阻力,促進(jìn)胚根突破種皮。

在多花黃精后熟過(guò)程中,4 ℃、交替和20 ℃ 3種層積方式的GA3含量都隨時(shí)間的推移表現(xiàn)為先降低后升高(如圖1)，其中4 ℃層積和20 ℃層積條件下種子在30 d時(shí)降為后熟過(guò)程中最低，分別為0.523 pmol/g和0.614 pmol/g；交替條件種子在40 d時(shí)達(dá)最低值(為0.621 pmol/g)。如圖1表明，層積處理對(duì)赤霉素?zé)o顯著影響。

圖1 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間赤霉素含量的變化

在種子后熟過(guò)程中(如圖2)， 隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，4 ℃條件下的IAA含量隨時(shí)間的推移表現(xiàn)為先降低后升高再降低的趨勢(shì)，在30 d和40 d分別達(dá)到整個(gè)后熟過(guò)程中的最低值和最高值，分別為0.141μmol/g和0.201μmol/g,后持續(xù)下降直到層積結(jié)束；20 ℃條件下，種子在前40 d 有小幅度的升降，為0.18μmol/g，在50～70 d開始下降,70 d時(shí)為0.165μmol/g；交替條件下，在10 d時(shí)IAA含量由最初的0.175μmol/g降低為0.154μmol/g，在20 d時(shí)上升后再下降，在40 d時(shí)達(dá)到后熟過(guò)程中的最低值0.123μmol/g，后有小幅升高直至層積結(jié)束，為0.131μmol/g。4 ℃條件下的波動(dòng)顯著可能說(shuō)明4 ℃條件下IAA參與了種子后熟某些機(jī)制的調(diào)控，或者是對(duì)ABA的抑制并且反應(yīng)活躍。

在種子后熟過(guò)程中(如圖3)，在20 ℃層積的貯藏條件下，層積20 d后CTK含量從191.21 ng/g 上升為267.00 ng/g，30 d快速下降為188.36 ng/g，隨著時(shí)間小幅變化，70 d時(shí)上升為288.03 ng/g；在20 ℃層積、4 ℃層積這2種貯藏條件下，種子的CTK含量變化趨勢(shì)基本一致，均隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢(shì)，不同的是，不同貯藏條件下種子CTK含量在整個(gè)層積過(guò)程中達(dá)到峰值的時(shí)間先后略有差異，在4 ℃條件下，CTK含量出現(xiàn)2個(gè)峰值，層積30 d后達(dá)到第1個(gè)峰值，為293.73 ng/g，之后逐漸下降，層積50 d后有小幅回升，到層積60 d時(shí)達(dá)到第2個(gè)峰值，為301.32 ng/g，之后逐漸下降直到層積結(jié)束；在20 ℃條件下，2個(gè)雙峰出現(xiàn)在20 d和40 d，分別為267.00 ng/g和285.13 ng/g，隨后又開始下降再升高，到70 d層積結(jié)束時(shí)為 288.03 ng/g。

圖2 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間生長(zhǎng)素含量的變化

圖3 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間細(xì)胞分裂素含量的變化

圖4 不同貯藏條件下多花黃精種子后熟期間脫落酸含量的變化

在種子后熟過(guò)程中(如圖4)，在3種不同貯藏條件下，ABA含量差異明顯。在4 ℃層積貯藏條件下，層積10 d后ABA含量從651.23 ng/g 下降為345.74 ng/g，隨著時(shí)間小幅變化，40 d時(shí)上升為469.82 ng/g，隨后下降再上升，層積結(jié)束時(shí)為417.20 ng/g；在20 ℃層積貯藏條件下，種子的ABA含量隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)出先小幅度升高后下降再升高，50 d時(shí)為后熟過(guò)程中最小值，為703.85 ng/g，層積結(jié)束時(shí)為714.06 ng/g；在交替層積貯藏條件下，隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)出先小幅度降低后在50 d快速升高，在60 d達(dá)到最大值，為795.73 ng/g，后下降，層積結(jié)束時(shí)為714.06 ng/g。

3 討 論

多花黃精種子具有胚后熟的習(xí)性，發(fā)芽率低，對(duì)多花黃精種子育苗與育種工作的開展造成阻礙，但目前有關(guān)多花黃精種胚后熟的機(jī)制方面的研究較少。通過(guò)對(duì)多花黃精種胚后熟過(guò)程中ABA、GA3、IAA和CTK等幾種主要內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律研究，探索縮短或延長(zhǎng)種胚發(fā)育時(shí)期的方法和途徑，為種胚后熟機(jī)理的深入研究和生產(chǎn)中的種苗繁殖提供依據(jù)。

3.1 GA3, IAA對(duì)多花黃精種子后熟的調(diào)控作用不明顯

在多數(shù)休眠種子中，GA3含量和ABA含量之間的平衡關(guān)系是種子破除休眠的關(guān)鍵條件。但是在本實(shí)驗(yàn)的多花黃精種子層積過(guò)程中，種子內(nèi)檢測(cè)到的GA3和IAA含量都非常低,且變化不明顯，可以推測(cè)多花黃精種子休眠解除與GA3和IAA水平的變化關(guān)系不大。GA3在整個(gè)層積過(guò)程含量較低，變化不明顯，一直維持在0.5～1.0 pmol/g之間，凡是能夠正常發(fā)芽的種子均存在具有生理活性的赤霉素，但是存在生理活性的種子不一定能發(fā)芽[25]，仍需要滿足其他利于種子發(fā)芽的生理?xiàng)l件，說(shuō)明赤霉素可能不是打破多花黃精種子休眠主要因素，這與史靜等[26]的研究結(jié)果類似。另一方面，考慮到GA3和IAA難提取和易分解的特性，故不能排除在本實(shí)驗(yàn)中GA3和IAA因提取和保藏方法不當(dāng)，可能造成檢查結(jié)果存在偏差。

3.2 ABA、CTK可能參與了多花黃精種子的后熟生理調(diào)控

多花黃精種子在層積處理0～70 d中，在4 ℃貯藏條件下，CTK的含量表現(xiàn)出先升高后下降再升高再下降的趨勢(shì)，出現(xiàn)了2個(gè)峰值，分別為第30天和第60天，含量分別為293.73 ng/g和301.32 ng/g，而ABA含量在貯藏30 d和60 d時(shí)為后熟過(guò)程中的2個(gè)谷底值，可以發(fā)現(xiàn)CTK和ABA含量的變化趨勢(shì)相反，說(shuō)明這2種激素在調(diào)控著種子的休眠與萌發(fā)；同樣在20 ℃層積和交替層積貯藏條件下，在第60天，種子CTK含量出現(xiàn)迅速下降的同時(shí)發(fā)現(xiàn)ABA的含量出現(xiàn)上升的情況，再次說(shuō)明CTK和ABA這2種激素在互相影響，調(diào)控著種子的休眠與萌發(fā)。故推測(cè)CTK和ABA可能參與了多花黃精種子胚后熟生理調(diào)控。在肉蓯蓉種子層積處理破除休眠的研究[27-28]中也曾發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素含量的顯著升高，并指出細(xì)胞分裂素促進(jìn)種子萌發(fā)相關(guān)酶活性的增強(qiáng)，還可能對(duì)拮抗種子內(nèi)含萌發(fā)抑制物有利。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在層積過(guò)程中，與其它2種貯藏條件相比，4 ℃貯藏條件下的ABA的含量最低，CTK含量也相對(duì)較高，可能表示4 ℃條件下進(jìn)行層積處理更適于多花黃精種子打破休眠，這與種子萌發(fā)試驗(yàn)中4 ℃貯藏條件下種子萌發(fā)率最高的結(jié)果相一致。

3.3 多花黃精種子在胚后熟過(guò)程中的關(guān)鍵期

在20～40 d期間，多花黃精種子激素CTK/ABA含量的比值在整個(gè)層積過(guò)程中表現(xiàn)出升高的現(xiàn)象，有利于種子萌發(fā)。因此可以認(rèn)為，在整個(gè)層積處理過(guò)程中，20～40 d是多花黃精種子打破休眠的一個(gè)關(guān)鍵期。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)不同貯藏條件下多花黃精種子植物激素含量及種子成活率的動(dòng)態(tài)測(cè)定，結(jié)果表明：

多花黃精種子層積第20～40天是胚后熟的關(guān)鍵期，種子代謝最為活躍。

4 ℃層積貯藏最有利于多花黃精種子萌發(fā)，發(fā)芽率達(dá)72.33%。超低溫條件貯藏不利于種子生活力的保持。