王文倩 潘曉明

（金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江 金華 321007）

鎘（cadmium，Cd）作為一種普遍存在于環(huán)境中的有毒重金屬，可以通過(guò)食物鏈或通過(guò)直接暴露的方式富集在人體中。發(fā)生在日本的“痛痛病”事件讓人們深刻的意識(shí)到了鎘污染對(duì)人身體健康造成的危害，而近年來(lái)發(fā)生的“鎘大米”事件也引起了人們對(duì)鎘污染的高度重視，鎘污染正通過(guò)多種方式威脅著人類的健康， 所以人們非常關(guān)注鎘污染的問(wèn)題。鎘是一種有潛在毒性的重金屬，在進(jìn)入人體后，首先在肝臟中與金屬硫蛋白結(jié)合形成鎘-硫蛋白，再經(jīng)過(guò)血液輸送到腎臟隨尿液緩慢地排出。鎘在肝臟中蓄積，可引起肝細(xì)胞凋亡、壞死，并進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤[1,2]。

細(xì)胞自噬普遍存在于真核細(xì)胞中，幾乎所有的細(xì)胞都存在自噬現(xiàn)象[3]，是一種自我保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞自噬是細(xì)胞將自身的一些細(xì)胞器和蛋白質(zhì)包裹在特定的膜結(jié)構(gòu)中被溶酶體降解，期間產(chǎn)生的能量和小分子可供細(xì)胞再次利用，從而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，自噬還可以通過(guò)降解一些毒性成分從而保護(hù)機(jī)體避免損傷，使其更好地適應(yīng)環(huán)境。因此本研究旨在初步探討低濃度鎘（＜10μM）能否誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生自噬。為進(jìn)一步揭示鎘毒性機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞

WRL68 細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器

流式細(xì)胞儀（BD公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；DMSO（Amresco公司）；高糖DMEM（GIBCO公司）；CdCl2（Sigma公司）；LC3B兔抗人多克隆抗體（proteintech公司）；IgG-HRP羊抗兔多克隆抗體、β-actin（Bioworld公司）；胎牛、小牛血清（杭州四季青公司）

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加不同劑量CdCl2（4、8、10μm）處理12h，用尼康倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

氯化鎘處理細(xì)胞后，常規(guī)方法收集細(xì)胞，5%的戊二醛將樣品固定。然后再將戊二醛吸出，讓樣品和瓊脂融合形成瓊脂塊轉(zhuǎn)移到小瓶中，PBS沖洗。鋨酸固定后，梯度丙酮脫水，將樣品用環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋和聚合做成半薄切片，染色并光學(xué)顯微鏡定位。之后用醋酸鈾、檸檬酸鉛將超薄切片進(jìn)行染色。透射電鏡下觀察、拍照。

1.5 免疫印記（Western blot）檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

將WRL68細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組和不同濃度（2、4、8、10μM）CdCl2暴露12h和8μm CdCl2暴露不同的時(shí)間實(shí)驗(yàn)組。將預(yù)冷細(xì)胞裂解液加到收集細(xì)胞中，超聲后煮樣，離心2min，-70℃保存；在90V下將50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（12%）電泳2h；再在24V條件下轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上；然后用PBST封閉2h，洗膜；敷上一抗后置于4℃ 孵育過(guò)夜，再敷上二抗置于4℃孵育6h，曝光。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2.結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，細(xì)胞暴露CdCl2（4、8、10μm）12h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞與細(xì)胞間膜界限較清晰，基本沒(méi)有損傷，僅少許細(xì)胞有變圓跡象。

圖1 WRL68細(xì)胞加Cd 12h后顯微觀察結(jié)果

2.2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

如圖2所示，對(duì)照組形態(tài)基本完好，細(xì)胞核在細(xì)胞中央，為橢圓形，細(xì)胞器機(jī)構(gòu)正常，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)，核膜完整光滑，而在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞暴露8μm CdCl212h后出現(xiàn)了吞噬空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，有脫顆?，F(xiàn)象，大量的次級(jí)溶酶體樣結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。從形態(tài)學(xué)角度表明了鎘可能誘導(dǎo)了WRL68細(xì)胞產(chǎn)生自噬。

圖2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.3 Western blot 檢測(cè)自噬蛋白 LC3B-II/I 表達(dá)

由圖 3-A/C所示，細(xì)胞暴露CdCl2不同濃度（0.5、2、4、8、10μm）12h后，自噬蛋白 LC3B-II/I表達(dá)逐漸增加；而WRL68細(xì)胞暴露8μm鎘不同時(shí)間后（4、8、12、18、24h），自噬蛋白LC3B-II/I的表達(dá)均上升。提示鎘誘導(dǎo)了WRL68細(xì)胞的自噬，如圖 3-B/D。

圖3 Western blot 檢測(cè)自噬蛋白LC3B-II/I表達(dá)（n=3，mean±SEM；**P＜0.01 VS control，*P＜0.05 VS control）。

3.討論

細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到自噬誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)時(shí)，大量游離的雙層膜結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)在胞漿中，形成的膜結(jié)構(gòu)類似杯狀。杯狀分隔膜延伸后將被降解的胞漿成分以及可溶性蛋白包裹起來(lái)形成自噬小體[4]。自噬體的外膜與溶酶體膜結(jié)構(gòu)融合，二者內(nèi)容物合二為一，形成自噬-溶酶體，消化降解自噬體內(nèi)容物，產(chǎn)物被運(yùn)輸至細(xì)胞漿中，供細(xì)胞重復(fù)再利用。

肝臟是鎘進(jìn)入體后最先積累和產(chǎn)生毒性的主要部位，可以導(dǎo)致一系列損傷。因此本研究對(duì)象是人肝細(xì)胞。本研究運(yùn)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、透射電子顯微鏡技術(shù)、Western蛋白印跡等方法，共同驗(yàn)證 CdCl2（≤10μmol?L-1）誘導(dǎo)人肝細(xì)胞自噬。本研究將肝細(xì)胞用低濃度鎘處理后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)良好，基本沒(méi)有損傷；通過(guò)透射電鏡觀察到相對(duì)于對(duì)照組而言，實(shí)驗(yàn)組形成了自噬溶酶體和大量自噬空泡，細(xì)胞核固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也出現(xiàn)了腫脹。通過(guò)Western蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組自噬標(biāo)志蛋白LC3B-II/I的表達(dá)也增加了，這暗示低濃度鎘引起了細(xì)胞自噬的發(fā)生。

此外，Cui Q等[5]以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)自噬對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。而Chargui A等[6]發(fā)現(xiàn)低濃度鎘誘導(dǎo)了PCT細(xì)胞自噬發(fā)生，而基本沒(méi)有凋亡，此外還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬對(duì)凋亡起到了抑制作用，使細(xì)胞耐受力加強(qiáng)。那么，自噬對(duì)細(xì)胞有什么作用呢，保護(hù)？損害？自噬與凋亡之間存在什么關(guān)系呢？這仍然需要進(jìn)一步研究。因此后續(xù)研究將著重探討低濃度鎘處理肝細(xì)胞后自噬對(duì)凋亡的作用。這對(duì)于進(jìn)一步探究鎘致癌機(jī)理以及某些疾病的預(yù)防和預(yù)測(cè)提供重要的理論依據(jù)。