何香花 龐國防 張 為 謝海群 呂澤平 呂 淵 梁慶華 何本進(jìn) 楊 澤 胡才友※

阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆癥，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其病理改變主要為神經(jīng)元大量減少、老年斑(SP)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。神經(jīng)元纖維纏結(jié)的主要成分是β-淀粉樣蛋白(Aβ)和tau蛋白[1]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳因素和環(huán)境因素均有影響，基因和環(huán)境交互作用在AD的發(fā)生和發(fā)展中有著重要作用。雙生子研究提示AD是一個具有高度遺傳傾向的疾病，其遺傳度可達(dá)60%～80%[2]。載脂蛋白E(APOE)基因被公認(rèn)為是AD發(fā)病的遺傳易感基因[3,4]。除外APOE，越來越多的基因被認(rèn)為與AD的發(fā)病相關(guān)[5]。載脂蛋白C1基因(APOC1)基因編碼載脂蛋白C1，載脂蛋白C1是載脂蛋白家族中的一員，參與膽固醇的代謝、膜的重塑和神經(jīng)元的凋亡[6]，而膽固醇的代謝紊亂與AD有關(guān)[6,7]，因此APOC1基因可能參與AD的發(fā)病。既往的研究發(fā)現(xiàn)APOC1基因多態(tài)性是AD發(fā)病的危險因素，但研究結(jié)果不一致[8～10]。本文在中國南方人群中檢測APOC1基因rs11568822多態(tài)與AD的關(guān)系。

1.資料與方法

1.1 研究對象 AD組來自廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院、佛山市第一人民醫(yī)院的門診和住院病人患者，共300例，年齡61～99歲，其中男性138人例，女性162人例，平均年齡(74.92±9.35)歲。對照組來自廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院的健康體檢中心的體檢人群，對照組年齡60～96歲，其中男性143例，女性157例，平均年齡(73.67±7.29)歲。

所有AD患者的診斷均符合2007年8月Dubios等修訂的美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病學(xué)會可能的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。本研究中AD患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)起病年齡≥60歲。(2)具有以下特征的早期、顯著性的情景記憶損害：①患者本人或知情者報告的持續(xù)6個月以上的緩慢進(jìn)展的記憶功能變化；②顯著情景記憶損害的客觀證據(jù)：包括不能被線索提示、再認(rèn)測試改善或糾正的回憶困難；③情景記憶損害在起病或疾病進(jìn)展過程中可以單獨(dú)存在，或與其他認(rèn)知功能改變共存。(3)神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查無明顯陽性體征。(4)簡易智能量表(MMSE)提示癡呆：文盲MMSE≤17分，小學(xué)畢業(yè)MMSE≤20分;初中以上學(xué)歷MMSE≤24分。(5)頭顱CT無明顯異?；騼H為腦萎縮。(6)同意入組本課題組并簽署知情同意書。AD患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)突然起病，早期合并步態(tài)異常、癲癇發(fā)作、行為異常等。(2)有以下臨床表現(xiàn)：局灶性神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，如偏癱、感覺缺失、視野缺損等；早期椎體外系統(tǒng)表現(xiàn)。(3)其他導(dǎo)致記憶減退或相關(guān)表現(xiàn)的疾?。喝绶茿D性癡呆、抑郁癥、腦血管疾病、中毒性疾病、代謝性疾病。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60歲。(2)生活自理能力好，簡易智能量表得分：文盲MMSE>17分，小學(xué)畢業(yè)MMSE>20分;初中以上學(xué)歷MMSE>24分。(3)性別和年齡與LOAD人群匹配。(4)同意入組本課題組并簽署知情同意書。

本研究在《赫爾辛基宣言》的基本原則下進(jìn)行,符合我國法律法規(guī)。本研究獲得廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施，所有患者均知情同意參加本研究。

1.2 基因分型

1.2.1 基因組DNA的提?。簩⒀芯繉ο蟮?00μl經(jīng)EDTA-K2抗凝全血以3000rpm離心20min，棄去血漿，按照QIAampDNA Blood Mini Kit(QIAGEN)試劑盒使用說明書提取基因組DNA，取5μl提取產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠(含0.5μl/ml溴化乙啶)電泳鑒定，以DNA Marker DL 2000作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，在紫外燈下觀察產(chǎn)物電泳結(jié)果，其余樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因型的檢測：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及DNA測序檢測APOE4基因和APOC1基因rs11568822位點(diǎn)多態(tài)性。APOE4基因的引物：F：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGGTAC AC-3’，R：5’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’。APOC1基因rs11568822的引物為：F:5’-TCCCCGAACGA-ATAAACC3’，R:5’-AGGAGCCGCAGACAAAAT-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Tsingke golden mix17μl，Primer F(10p)0.75μl，Primer R(10p)0.75μl，gDNA(20ng/μl)1.5μl，共20μl體系。PCR擴(kuò)增條件如下：98℃ 2min1個循環(huán)；98℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸30s,共31個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸2min，最后置于16℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)條帶位置后送測序公司測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,統(tǒng)計結(jié)果由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較采用t檢驗,兩組等位基因和基因型分布頻率的差異采用卡方檢驗，采用Hardy-Weinberg equilibrium軟件對基因型進(jìn)行群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg平衡檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 研究對象的一般特征分析 本研究中，AD組和對照組的性別及年齡比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，AD組和對照組的基因型、等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡；APOEε4等位基因攜帶者與非攜帶者在AD組和對照組中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.614，95%CI:0.417～1.015，P=0.057，OR=0.651)，但APOEε2，APOEε3，APOEε4在AD組和對照組中的分布頻率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.774，P=0.034，見表1)。

表1 研究對象的一般特征

2.2 APOC1 rs11568822位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析 APOC1基因rs11568822多態(tài)位點(diǎn)經(jīng)酶切后產(chǎn)生一個4-bp CGTT插入(Insertion,I)/缺失(Deletion,D)多態(tài)，含DD,D/I,I/I三種基因型。AD組與對照組三種基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.914),等位基因D與I頻率分布在兩組之間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.674，見表2)。在APOEε4攜帶者中，AD組與對照組三種基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在APOEε4非攜帶者中，AD組與對照組三種基因型及等位基因頻率分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表2 APOC1 rs11568822位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析[例(%)]

表3 APOC1 rs11568822多態(tài)在APOE 4攜帶與非攜帶者中的基因型與等位基因頻率分析[例(%)]

注：*為Fisher確切概率法。

3.討論

APOC1基因主要在肝臟中表達(dá)，但在大腦中也能發(fā)現(xiàn)APOC1的大量表達(dá)。APOC1基因rs11568822CGTT插入多態(tài)位點(diǎn)位于APOC1基因的啟動子區(qū)域，活化后其表達(dá)水平是正常的1.5倍[12]。在患AD小鼠的神經(jīng)元纖維纏結(jié)中，APOC1被發(fā)現(xiàn)APOE和Aβ共存在于小鼠的腦組織中[12]。APOE對腦內(nèi)Aβ的清除其重要的作用，而APOC1通過作用于APOE依賴的脂質(zhì)代謝而延緩Aβ的清除[12]，進(jìn)而引起Aβ在腦內(nèi)的沉積[13]。

我們通過對中國南方的300例AD患者和300例對照組進(jìn)行APOC1 rs11568822多態(tài)與AD的相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)rs11568822多態(tài)是AD患病的危險因素，這與既往的研究結(jié)果不一致[8,9]。在一項通過對1668例AD患者和2120例對照組進(jìn)行薈萃分析的文章提示：APOC1基因rs11568822的插入多態(tài)可增加患AD的風(fēng)險2.07倍(95%可信區(qū)間：1.67～2.57)[8]。一項來自中國四川的研究發(fā)現(xiàn)APOC1基因rs11568822的插入多態(tài)可增加患中、重度AD的風(fēng)險，但未發(fā)現(xiàn)APOC1基因rs11568822的插入多態(tài)可增加患輕度AD的風(fēng)險[9]。另一項針對非洲裔美國人的研究同樣沒有發(fā)現(xiàn)APOC1基因rs11568822的插入多態(tài)可增加AD的患病風(fēng)險[10]。上述研究提示該基因多態(tài)性存在種族及地域差異。

我們的研究中，APOEε2，APOEε3，APOEε4在AD組和對照組中的分布頻率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)，其中APOEε4占比18.7%，這與之前我國四川的研究相近(13.4%)[9]和香港(16.9%)[14]，但稍低于臺灣(23.2%)[15]。這種差異可能是因為納入的AD人群的亞組不一樣所致，如輕中重度AD在各研究中的比例不一樣。

本研究未發(fā)現(xiàn)APOC1 rs11568822多態(tài)可增加AD的患病風(fēng)險，因本研究的樣本量偏小，且因種族的差異，尚不能肯定APOC1基因rs11568822多態(tài)與AD無關(guān)，更大樣本量的多中心隨機(jī)對照研究有待進(jìn)一步證明此項研究。