何香花 龐國防 張 為 謝海群 呂澤平 呂 淵 梁慶華 何本進(jìn) 楊 澤 胡才友※

阿爾茨海默病(AD)是常見的老年癡呆類型，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD的患病人數(shù)逐年增加，根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織的癡呆報(bào)告，目前共有4.75億癡呆患者，每年新增770萬，2030年將有7.56億癡呆患者，2050年將有13.55億癡呆患者[2]。AD由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用，其中遺傳因素的作用可占60%～80%[3]。積極尋找AD的遺傳學(xué)標(biāo)記物將有助于闡明疾病病因。載脂蛋白E(APOE)基因被公認(rèn)為是AD發(fā)病的遺傳易感基因[4]。除外APOE，越來越多的基因被認(rèn)為與AD的發(fā)病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)SORL1(SORL1)基因可增加AD的患病風(fēng)險(xiǎn)，但的研究結(jié)果不一致[5～7]。本文在中國南方人群中檢測SORL1基因rs2070045與rs2276412多態(tài)與AD的關(guān)系。

1.資料與方法

1.1 研究對象 AD組來自中國南方的廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院、佛山市第一人民醫(yī)院的門診和住院患者，共300例，年齡61～99歲，其中男性138例，女性162例，平均年齡(74.92±9.35)歲。對照組來自廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院的健康體檢中心的體檢人群，對照組年齡60～96歲，其中男性143例，女性157例，平均年齡(73.67±7.29)歲。

所有AD患者的診斷均符合2007年8月Dubios等修訂的美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病學(xué)會可能的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。本研究中AD患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)起病年齡≥60歲。(2)具有以下特征的早期、顯著性的情景記憶損害：①患者本人或知情者報(bào)告的持續(xù)6個月以上的緩慢進(jìn)展的記憶功能變化；②顯著情景記憶損害的客觀證據(jù)：包括不能被線索提示、再認(rèn)測試改善或糾正的回憶困難；③情景記憶損害在起病或疾病進(jìn)展過程中可以單獨(dú)存在，或與其他認(rèn)知功能改變共存。(3)神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查無明顯陽性體征。(4)簡易智能量表(MMSE)提示癡呆：文盲MMSE≤17分，小學(xué)畢業(yè)MMSE≤20分;初中以上學(xué)歷MMSE≤24分。(5)頭顱CT無明顯異?；騼H為腦萎縮。(6)同意入組本課題組并簽署知情同意書。AD患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)突然起病，早期合并步態(tài)異常、癲癇發(fā)作、行為異常等。(2)有以下臨床表現(xiàn)：局灶性神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，如偏癱、感覺缺失、視野缺損等；早期椎體外系統(tǒng)表現(xiàn)。(3)其他導(dǎo)致記憶減退或相關(guān)表現(xiàn)的疾?。喝绶茿D性癡呆、抑郁癥、腦血管疾病、中毒性疾病、代謝性疾病。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60歲。(2)生活自理能力好，簡易智能量表得分：文盲MMSE>17分，小學(xué)畢業(yè)MMSE>20分;初中以上學(xué)歷MMSE>24分。(3)性別和年齡與LOAD人群匹配。(4)同意入組本課題組并簽署知情同意書。

本研究在《赫爾辛基宣言》的基本原則下進(jìn)行,符合我國法律法規(guī)。本研究獲得廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院和佛山市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施，所有患者均知情同意參加本研究。

1.2 基因分型

1.2.1 基因組DNA的提取：將研究對象的200μl經(jīng)EDTA-K2抗凝的全血以3000rpm離心20min，棄去血漿，按照QIAampDNA Blood Mini Kit(QIAGEN)試劑盒使用說明書提取基因組DNA，取5μl提取產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠(含0.5μl/ml溴化乙啶)電泳鑒定，以DNA Marker DL 2000作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，在紫外燈下觀察產(chǎn)物電泳結(jié)果，其余樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因型的檢測：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及DNA測序檢測APOE4基因和SORL1基因rs2070045與rs2276412位點(diǎn)多態(tài)性。APOE基因的引物：F：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGGTAC AC-3’，R：5’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’。SORL1基因rs2070045的引物為F:5’-CTCCTCCTGGGTATGTGACG-3’， R：5’-CTGTCAACTGAGTCCAGGAAGT-3’，rs2276412的引物為：F：5’-CTAGAGTTGGAGCCCTGTGTTC-3’，R：5’-CAAAACACGGAATCAGCCAGG-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Tsingke golden mix 17μl，Primer F(10p) 0.75μl，Primer R(10p)0.75μl，gDNA(20ng/μl) 1.5μl，共20μl體系。PCR擴(kuò)增條件如下：98℃ 2min 1個循環(huán)；98℃變性25s,60℃退火20s,72℃延伸30s,共31個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸2min，最后置于16℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)條帶位置后送測序公司測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較采用t檢驗(yàn),兩組等位基因和基因型分布頻率的差異采用卡方檢驗(yàn)，采用Hardy-Weinberg equilibrium軟件對基因型進(jìn)行群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，Logistic回歸分析單核苷酸多態(tài)之間的交互作用。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 研究對象的一般特征 AD組和對照組的性別及年齡比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；AD組和對照組的基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡；APOEε4等位基因攜帶者與非攜帶者在AD組和對照組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.614，95%CI:0.417～1.015，P=0.057，OR=0.651)，但APOEε2,APOEε3,APOEε4在AD組和對照組中的分布頻率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.774，P=0.034,見表1)。

2.2 SORL1 rs2070045位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析 SORL1基因rs2070045為G/T多態(tài)性，包括G/G,G/T,T/T三種基因型。AD組與對照組三種基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.659),等位基因G與T頻率分布在兩組之間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.771，見表2)。在APOEε4攜帶者中，SORL1 rs2070045多態(tài)在AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且在APOEε4非攜帶者中，SORL1 rs2070045多態(tài)性AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異仍然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表1 研究對象的一般特征

表2 SORL1 rs2070045位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析[例(%)]

表3 SORL1 rs2070045多態(tài)在APOE 4攜帶與非攜帶者中的基因型與等位基因頻率分析[例(%)]

表4 SORL1 rs2276412位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析[例(%)]

注：*為Fisher確切概率法。

2.3 SORL1 rs2276412位點(diǎn)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析 SORL1基因rs2276412為C/T多態(tài)性，包括C/C,C/T,T/T三種基因型。AD組與對照組三種基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.841),等位基因G與T頻率分布在兩組之間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.607，見表4)。在APOEε4攜帶者中，SORL1 rs2276412多態(tài)在AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039，P=0.043)；但在APOEε4非攜帶者中，SORL1 rs2276412多態(tài)性AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表5)。進(jìn)一步的Logistic回歸分析未能發(fā)現(xiàn)APOEε4與rs2276412多態(tài)有交互作用(P=0.422)。

表5 SORL1 rs2276412多態(tài)在APOE 4攜帶與非攜帶者中的基因型與等位基因頻率分析[例(%)]

注：*為Fisher確切概率法。

3.討論

AD典型的病理改變是神經(jīng)炎性斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)、神經(jīng)元及突觸缺失和膠質(zhì)細(xì)胞增生[1]。神經(jīng)炎性斑是以β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心，核心周圍是更多的Aβ和各種細(xì)胞。Aβ是一種具有神經(jīng)毒性的物質(zhì)，其生成和清除失衡會導(dǎo)致神經(jīng)元變性甚至缺失[8]。分揀蛋白相關(guān)受體L1(SORL1)基因在AD患者大腦中的表達(dá)水平明顯低于正常對照組，其表達(dá)產(chǎn)物為分揀蛋白受體1(SORL1)參與淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解環(huán)節(jié)，抑制Aβ(Aβ)的生成[9]。

本研究通過對中國南方300例AD患者和300例對照組進(jìn)行SORL1 rs2070045多態(tài)性的分析，未發(fā)現(xiàn)SORL1 rs2070045在AD組和對照組的基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在APOEε4攜帶者與非攜帶者中，rs2070045在AD組和對照組的基因型和等位基因頻率差異仍然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瑞典一項(xiàng)對1558例癡呆(其中有1270例為AD患者)和2179例對照者對SORL1基因的6個多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)rs2070045多態(tài)與AD的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；但隨后的Meta分析提示rs2070045多態(tài)可增加AD的患病風(fēng)險(xiǎn)[5]。同樣，來自臺灣地區(qū)的一項(xiàng)對798例AD患者和157例輕度認(rèn)知障礙患者及401例對照組SORL1基因的8個單核苷酸多態(tài)進(jìn)行的病例對照研究也未發(fā)現(xiàn)rs2070045多態(tài)可增加患AD的風(fēng)險(xiǎn)[7]。來自中國北京的一項(xiàng)研究對77例AD和100例對照組的研究中，發(fā)現(xiàn)SORL1 rs2070045是AD患病的危險(xiǎn)因素[10]。上述研究結(jié)果的不一致可能因?yàn)槿朔N地域、樣本量等不同所致，有待更大規(guī)模的研究進(jìn)一步闡明rs2070045多態(tài)與AD的關(guān)系。

本研究未發(fā)現(xiàn)SORL1 rs2276412在AD組和對照組的基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在APOEε4攜帶者中，SORL1 rs2276412多態(tài)在AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039，P=0.043)。在APOEε4非攜帶者中，SORL1 rs2276412多態(tài)在AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在我們的研究中，T等位基因在AD患者中僅占5.7%，屬于低頻率等位基因，這與之前歐洲及我國北方的人群的研究中的T等位基因比例相符[11,12]。我們的研究未能發(fā)現(xiàn)SORL1 rs2276412多態(tài)是AD的危險(xiǎn)因素，這與中國北方人群的研究不一致[12]，考慮可能與我們的樣本量及地域人種有關(guān)，多中心大樣本的研究有望解決這以問題。

雖然在APOEε4攜帶者中，SORL1 rs2276412多態(tài)在AD組與對照組的基因型與等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039，P=0.043)，但Logistic回歸分析未能發(fā)現(xiàn)APOEε4和rs2276412多態(tài)存在交互作用，因此APOEε4的存在影響rs2276412基因型及等位基因頻率的分布，但基因-基因之間是否存在交互作用尚需大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。