侯志凌 倪 蕾 唐慶喜 倪健 楊 玉 趙東旭 王銳峰 李 影 赫 赤

骨肉瘤是一種常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病具有年齡雙峰分布的特性。青少年和老年人是骨肉瘤高發(fā)的年齡段，其中青少年高峰集中于大約15歲，主要由原發(fā)性骨肉瘤組成，發(fā)病率約為4.4/100萬人[1]。第二個峰值集中于75歲，主要由與佩吉特病或其他骨性病變相關(guān)的繼發(fā)性骨肉瘤組成。在過去50年中，隨著手術(shù)切除和新型輔助化療技術(shù)的快速發(fā)展，骨肉瘤患者的總生存期和術(shù)后功能狀態(tài)得到了顯著的改善，第5年生存率從不足20%到目前70%左右[2]。此外，大多數(shù)患者目前能夠通過使用肢體保留重建技術(shù)來避免截肢并保留其相關(guān)的肢體[3]。

表柔比星(EPI)是一種蒽環(huán)類藥物，對多種腫瘤生長均有抑制作用。聯(lián)合蒽環(huán)類抗腫瘤藥物治療骨肉瘤為目前一種應(yīng)用十分廣泛的化療方法，但由于高劑量使用藥物產(chǎn)生患者無法耐受的不良反應(yīng)及多藥耐藥基因的突變使細(xì)胞中p-糖蛋白泵的性質(zhì)發(fā)生改變，從而降低了化療藥物的有效性[4]。研究人員都在尋找新的化療方案以提高骨肉瘤的生存率和緩解率。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是細(xì)胞內(nèi)信號通路中重要的傳導(dǎo)分子[5]，其中Akt是PI3K信號傳導(dǎo)的重要下游效應(yīng)因子，并調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，包括抑制細(xì)胞凋亡，刺激mTORC1依賴性細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[6]。此外，葡萄糖和谷氨酰胺被認(rèn)為是癌細(xì)胞增殖的必需營養(yǎng)素，而PI3K/Akt信號傳導(dǎo)已被證明可調(diào)節(jié)兩種營養(yǎng)素的細(xì)胞代謝[7]?，F(xiàn)已證實(shí)許多癌癥均與PI3K/Akt信號通路過度活化導(dǎo)致，如乳腺癌PI3K過度磷酸化和隨后的下游PDK1介導(dǎo)的Akt激活，最終促進(jìn)細(xì)胞周期促進(jìn)基因，如CDK1和PCNA的上調(diào)[8]。但是PI3K/Akt通路是否參與骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展，其抑制劑LY294002與表柔比星聯(lián)合應(yīng)用是否會抑制骨肉瘤細(xì)胞惡性增生尚不清楚。因此本課題應(yīng)用EPI聯(lián)合LY294002，研究阻斷PI3K/Akt通路后是否會增強(qiáng)表柔比星對骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及促進(jìn)凋亡，從而為臨床應(yīng)用和治療骨肉瘤提供新思路和理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞株MG53購置于中科院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(青、鏈霉素)RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)期生長的情況下進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑：PI3K/Akt抑制劑LY294002(Beyotime生物技術(shù)有限公司)；表柔比星(輝瑞)；RPMI1640(Gibco公司，美國)；胎牛血清(FBS,杭州四季青生物有限公司)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；鼠抗β-tublin、兔抗PARP、鼠抗caspase3多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MG63細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml每孔，在每孔中加入不同濃度組合的藥物。EPI的濃度為1μM,3μM,10μM,30μM，LY294002的濃度為10μM,20μM,40μM,80μM，并用RPMI1640替代藥物作為空白對照，每組濃度設(shè)置3個平行孔。于37℃ 5%CO2飽和濕度的條件下進(jìn)行孵育72h。再于每孔加入8μl CCK-8溶液，并置于培養(yǎng)箱孵育4h，加入20%SDS溶解晶體后，用酶標(biāo)儀器在450nm波長下測各孔光密度值。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡：收集LY294002和表柔比星不同濃度組合處理后的MG63細(xì)胞，4℃離心去上清液后PBS洗2次。加入5μl Annexin V-FITC，混勻后室溫避光15min。再加入10μl PI，孵育5min后迅速上機(jī)進(jìn)行凋亡檢測，記錄結(jié)果。采用Cell Quest軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 Western-blotting法檢測蛋白表達(dá)：將各組不同濃度細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗3次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。利用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。按20μg體系進(jìn)行上樣。于80V，120min條件下進(jìn)行電泳，后350mA，2h濕法轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉-Tris鹽酸緩沖液4℃封閉4h。一抗分別為Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP(1:1000),二抗分別為山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體(1:5000)，TBS-T沖洗3次。加入ECL發(fā)光液，Tanon 5200采集圖像，對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中Mean±SD用于表示定量數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)用于比較組間均數(shù)。以P<0.01認(rèn)為組間存在顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測表柔比星聯(lián)合LY294002對骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖抑制作用 經(jīng)過CCK-8試劑盒處理顯示：與空白對照組相比較，單用EPI或LY294002均表現(xiàn)出細(xì)增殖抑制的作用，并且其抑制強(qiáng)度與給藥濃度成劑量相關(guān)性。當(dāng)EPI中加入LY294002后，其骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用比兩藥單用時的抑制率更為明顯。例如，單用30μMEPI的細(xì)胞增殖抑制率為(50.7±1.3)%，而單用LY294002的細(xì)胞增殖抑制率為(36.9±4.3)%。兩者合用時，則其生長的抑制為(75±1.6)%。(圖1)

圖1 EPI聯(lián)合LY294002對MG63細(xì)胞的增殖抑制率(%)

2.2 表柔比星聯(lián)合LY294002對人骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡的影響 通過Annexin V-FITC/PI雙染法研究表柔比星聯(lián)合LY294002對MG63的凋亡影響。結(jié)果顯示：經(jīng)過EPI和LY294002處理后的細(xì)胞凋亡率明顯增加，對照組的細(xì)胞凋亡率為(6±1.2)%，單獨(dú)用10μM EPI處理的細(xì)胞凋亡率為(21.5±2)%，單獨(dú)用20μM LY294002處理的細(xì)胞凋亡率為(32.1±3)%，兩者合用的細(xì)胞凋亡率為(65.2±5)%(P<0.01)，表明兩者合用可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖2 EPI聯(lián)合LY294002對MG63細(xì)胞凋亡的影響(%)

2.3 表柔比星與LY294002使用對MG63細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白的影響 通過Western-blotting法檢測經(jīng)過藥物處理后細(xì)胞表達(dá)Cleaved caspase-3與Cleaved PARP的情況。結(jié)果顯示，經(jīng)過EPI+LY294002相應(yīng)濃度處理的細(xì)胞與單獨(dú)經(jīng)過EPI處理的細(xì)胞相比，其Cleaved caspase-3與Cleaved PARP蛋白表達(dá)增加。表明LY294002能夠增強(qiáng)表柔比星誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。并且當(dāng)?shù)孜镏型瑫r存在LY294002時，Cleaved caspase-3與Cleaved PARP的表達(dá)量隨EPI的濃度增加而相應(yīng)增加。

圖3 WB檢測EPI(3-10μM)和LY294002(20μM)單獨(dú)及聯(lián)合用藥在MG63細(xì)胞中的Cleaved PARP及Cleaved caspase3的表達(dá)；6條泳道依次代表空白對照組、3μM EPI組、10μM EPI組、20μM LY294002組、20μM LY294002+ 3μM EPI組與20μM LY294002+10μM EPI組。

3.討論

骨肉瘤發(fā)病率占惡性實(shí)體腫瘤發(fā)病率的0.2%，在原發(fā)性骨腫瘤中占據(jù)首位，是一種較為常見、惡性程度高的骨腫瘤類型，預(yù)后較差，目前病因不清、機(jī)制不明、發(fā)病因素復(fù)雜，并高發(fā)于青少年[9]。骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)展，轉(zhuǎn)移及耐藥的進(jìn)展是目前臨床治療失敗的主要原因，尤其是細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生對目前常規(guī)的化療藥物，如表柔比星、順鉑等均具有較強(qiáng)的抵抗作用[10]。因此尋找新的方法提高腫瘤對化療藥物的敏感性及安全實(shí)施化療是亟待解決的問題，并具有現(xiàn)實(shí)意義。

表柔比星作為目前臨床上常規(guī)的化療藥物，其可直接嵌入DNA核堿對之間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA生成，從而起到抗腫瘤的作用，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性致使治療效果不甚理想[11]。Guo等[12]提出在連續(xù)的化學(xué)藥物治療過程中，腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性也會逐漸增強(qiáng)，這也是導(dǎo)致治療失敗的重要原因。

許多研究表明PI3K/Akt通路參與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控、靶向抑制等重要生理過程，應(yīng)用靶向抑制劑與化療藥物結(jié)合的治療方法也成為熱點(diǎn)。王曉芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)LY294002可抑制淋巴瘤細(xì)胞的增殖并且可能在治療淋巴瘤中具有化療增敏作用。尹紀(jì)瑛等[14]發(fā)現(xiàn)LY294002可能通過PI3K/Akt/mTOR通路導(dǎo)致結(jié)直腸癌CSCs周期阻滯，抑制其自我更新、增殖能力。因此，我們推測PI3K/Akt抑制劑LY294002可以在一定程度上作為化療藥物的增敏劑，增加腫瘤細(xì)胞對表柔比星的敏感性。

在本實(shí)驗(yàn)中的CCK-8檢測的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EPI加入LY294002后，骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用比兩藥單用時的抑制率更為明顯。30μM EPI的細(xì)胞增殖抑制率為(50.7±1.3)%，而10μM EPI+20μM LY294002則可同樣達(dá)到相近的細(xì)胞抑制率，表明PI3K/Akt抑制劑的加入可以減少EPI的用量，而EPI用量的減少可增加患者對化療藥物的耐受性，并減少腫瘤細(xì)胞對EPI耐藥的發(fā)生。同樣在Annexin V-FITC/PI雙染法中10μM EPI處理的細(xì)胞凋亡率為(21.5±2)%，而10μM EPI+20μM LY294002的細(xì)胞凋亡率為(65.2±5)%(P<0.01)，表明LY294002可以與EPI協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western-blotting的結(jié)果顯示：10μM EPI+20μM LY294002與10μM EPI相比Cleaved Caspase-3與Cleaved PARP的蛋白水平顯著增加，說明LY294002通過抑制PI3K/Akt通路參與Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表達(dá)調(diào)控,這種促進(jìn)作用可能與抑制PI3K致其下游AKT的活性減弱進(jìn)而激活caspase-3、PARP等參與的凋亡通路所介導(dǎo)相關(guān)[15,16]。

綜上所述，本研究證實(shí)EPI和LY294002可協(xié)同抑制體外人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，這種凋亡作用很有可能與PI3K/Akt被抑制導(dǎo)致下游Akt的磷酸化水平降低進(jìn)而促發(fā)caspase平臺與凋亡小體等相關(guān)。然而LY294002增強(qiáng)MG63對EPI敏感性的分子機(jī)制并未闡明，需要進(jìn)一步深入研究。