鄧秋菊，李慧穎，向琳

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織缺血后，恢復(fù)組織血液流通加重了缺血性損傷，其與心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑燃膊“l(fā)生有關(guān)，心肌缺血再灌注損傷伴隨有心肌細胞氧化損傷、細胞過度凋亡等病理學(xué)變化[1,2]。高遷移率蛋白1（HMGB1）是一種染色體結(jié)合蛋白，其在染色體結(jié)構(gòu)維持、基因的轉(zhuǎn)錄等過程中具有重要作用。當(dāng)組織受到損傷后，HMGB1可作為一種警報素從壞死細胞、應(yīng)激細胞、活化的免疫細胞等中被釋放出來，參與心肌損傷[3,4]。研究顯示，HMGB1參與糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注、心肌肥大等疾病的發(fā)生，心肌細胞可以釋放HMGB1，參與心肌組織疾病的發(fā)生[5-7]。本研究通過構(gòu)建缺氧復(fù)氧心肌細胞模型，研究缺氧復(fù)氧對心肌細胞釋放HMGB1的影響，通過小RNA干擾技術(shù)下調(diào)心肌細胞中HMGB1的合成，研究HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細胞氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2細胞購自于美國ATCC；HMGB1siRNA和siRNA control購自英國Abbexa；Lipofectamine 2000購自美國invitrogen；HMGB1、GAPDH引物由南京金斯瑞合成；qRT-PCR和cDNA合成試劑均購自美國Thermo；丙二醛（MDA）含量測定試劑盒購自美國Sigma；乳酸脫氫酶（LDH）含量測定試劑盒購自沈陽萬類生物；超氧化物歧化酶（SOD）含量測定試劑盒購自日本DOJINDO；HMGB1含量測定試劑盒購自上海西唐生物；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved Caspase-9）抗體購自美國CTS。

1.2 缺氧復(fù)氧心肌細胞模型構(gòu)建H9C2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中。缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建：H9C2細胞密度約為60%時，用移液槍把培養(yǎng)液吸除以后，再添加不含血清的DMEM，把細胞放在95%N2、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12 h。取出培養(yǎng)板，把原來的培養(yǎng)液倒掉，換成10%胎牛血清的DMEM，把細胞放置于95%空氣、5% CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧約4 h，即為缺氧復(fù)氧心肌細胞模型。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組H9C2細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度約為70%時，進行細胞轉(zhuǎn)染。取HMGB1 siRNA和siRNA control各5 μl分別與5μl的Lipofectamine 2000混合后，再與250 μl的Opti-MEM混合稀釋。在室溫中結(jié)合5 min后，添加到6孔板中，培養(yǎng)6 h后，把細胞培養(yǎng)液換成是含有10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。H9C2細胞分為正常組、模型組、陰性組、干擾組。轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA和siRNA control后的心肌細胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧處理以后分別記為干擾組和陰性組，以不做轉(zhuǎn)染的心肌細胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后記為模型組，以正常培養(yǎng)不做任何處理的心肌細胞記為正常組。

1.4 qRT-PCR檢測心肌細胞中HMGB1 mRNA水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細胞按照上述方法處理以后，提取細胞中的總RNA，測定提取的RNA OD260 nm/OD280 nm介于1.8～2.0之間。取各組RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄。取cDNA，進行qRT-PCR，分兩步擴增，95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s×40個循環(huán)。以GAPDH把對照進行歸一，用2-△△Ct法計算基因轉(zhuǎn)錄水平。引物：GAPDH 上游 5，-TCCACCACCCTGTTGGTG TTA-3’，下游 5，-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3’。

HMGB1上游5，-CGGAGTCAACGGATTTGGT CGTAT-3’，下游5，-AGCCTTCTCCATGGTGGT GAAGAC-3’。本實驗重復(fù)3次。

1.5 ELISA測定細胞分泌HMGB1水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細胞按照上述方法處理以后，收集細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法測定各組培養(yǎng)液上清中HMGB1含量，步驟參照試劑盒說明書。本實驗重復(fù)3次。

1.6 細胞中MDA、SOD水平和培養(yǎng)液中LDH水平測定正常組、模型組、陰性組、干擾組細胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清和各組細胞，用硫代巴比妥酸比色法檢測細胞中MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測細胞中SOD含量，用二硝基苯肼顯色法檢測上清中LDH，步驟分別參照試劑盒說明書。本實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡正常組、模型組、陰性組、干擾組細胞在按照上述方法處理以后，加入胰蛋白酶消化以后，1000 g離心10 min，把上清吸除以后，添加500 μl的Binding buffer，再添加10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC，用流式細胞儀檢測凋亡，重復(fù)3次。

1.8 Western blot測定Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細胞在按照上述方法處理后，PBS洗滌各組心肌細胞并加入預(yù)冷的裂解緩沖液，在冰上裂解30 min后離心取上清，以BCA法檢測蛋白濃度進行蛋白定量后，進行10% SDSPAGE電泳，上樣量體積含20 μg蛋白。電泳結(jié)束后，將目的膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，洗膜，室溫孵育稀釋好的Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9及內(nèi)參GAPDH抗體（均為1:800稀釋）2 h，洗膜，加入二抗，室溫孵育1.5 h。ECL顯色液避光顯色，掃描圖像，以GAPDH的灰度值為內(nèi)參，分析各蛋白水平，重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)分析用SPSS 21.0軟件，計量資料以（±s）表示，多組差異比較均用單因素方差分析，組間比較均用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧后心肌細胞合成HMGB1水平模型組細胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細胞中HMGB1 mRNA水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細胞中HMGB1 mRNA水平與模型組相比沒有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細胞中HMGB1 mRNA水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 敲低HMGB1對缺氧復(fù)氧心肌細胞氧化損傷影響模型組細胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細胞中MDA水平明顯高于正常組，SOD水平明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細胞中MDA水平、SOD水平與模型組相比沒有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細胞中MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 敲低HMGB1對缺氧復(fù)氧心肌細胞凋亡影響模型組細胞凋亡率明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細胞凋亡率與模型組相比沒有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細胞凋亡率明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、表3）。

表1 各組細胞HMGB1合成水平（±s）

表1 各組細胞HMGB1合成水平（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 上清液中HMGB1含量（ng/106個細胞） 細胞內(nèi)HMGB1 mRNA正常組 1.90±0.17 1.00模型組 3.32±0.32a 2.97±0.24a陰性組 3.41±0.36b 2.99±0.28b干擾組 2.37±0.29c 1.86±0.14c

表2 各組細胞培養(yǎng)液中LDH水平及細胞中MDA、SOD水平（±s）

表2 各組細胞培養(yǎng)液中LDH水平及細胞中MDA、SOD水平（±s）

注：LDH：乳酸脫氫酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 LDH水平（U/L） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）正常組 514.25±65.87 6.27±0.52 124.36±10.28模型組 982.47±66.82a 14.68±1.47a 64.17±8.93a陰性組 986.73±74.29b 14.97±1.75b 65.31±9.68b干擾組 768.92±51.03c 8.64±0.71c 87.25±7.36c

2.4 敲低HMGB1對缺氧復(fù)氧心肌細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平影響模型組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細胞Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平與模型組相比沒有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細胞Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2、表4）。

3 討論

圖1 流式細胞術(shù)測定下調(diào)HMGB1對缺氧復(fù)氧心肌細胞凋亡影響

表3 各組心肌細胞凋亡率（±s）

表3 各組心肌細胞凋亡率（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 凋亡率（%）正常組 4.32±0.08模型組 38.25±3.21a陰性組 39.12±4.67b干擾組 22.76±2.85c

圖2 Western blot測定下調(diào)HMGB1對細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白影響

表4 各組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平（±s）

表4 各組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 Cleaved Caspase-3 Bax Cleaved Caspase-9正常組 0.46±0.05 0.35±0.03 0.12±0.02模型組 0.84±0.09a 0.76±0.08a 0.71±0.05a陰性組 0.83±0.07b 0.75±0.07b 0.70±0.06b干擾組 0.67±0.06c 0.43±0.06c 0.52±0.08c

HMGB1蛋白由215個氨基酸組成，屬于非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可以通過核小體與DNA結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達[8,9]。HMGB1在細胞內(nèi)和細胞外都具有調(diào)控細胞生物學(xué)功能的作用，其可被損傷的細胞釋放至細胞外，調(diào)控組織炎癥[10]，在胃腸道相關(guān)炎癥、心肌炎等方面具有重要作用。近年來的研究顯示，HMGB1參與心肌缺血再灌注損傷，在心肌缺血再灌注損傷模型中表達上調(diào)[11]。高糖誘導(dǎo)心肌細胞中HMGB1的合成和分泌，并且參與高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化損傷過程[12]。本實驗的研究結(jié)果顯示，HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細胞中轉(zhuǎn)錄水平升高，細胞分泌的HMGB1水平也升高，說明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞合成和分泌HMGB1，這與上述報道相一致。

心肌缺血再灌注發(fā)生時，會產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致細胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，引起細胞膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致原本存在于細胞內(nèi)的LDH被泄漏到細胞外[13]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，檢測其表達水平的高低可以間接反應(yīng)細胞內(nèi)氧化損傷程度[14]。細胞內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的維持與細胞內(nèi)的抗氧化和氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡有關(guān)，SOD是目前發(fā)現(xiàn)的氧自由基的頭號天敵，可降低細胞內(nèi)氧自由基水平，減輕氧化損傷[15,16]。本實驗結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細胞中MDA合成水平升高，細胞內(nèi)的SOD水平降低，細胞培養(yǎng)液中的LDH水平升高，說明成功構(gòu)建了缺氧復(fù)氧氧化損傷模型，敲低HMGB1可以降低缺氧復(fù)氧心肌細胞合成MDA，提高SOD水平，減少LDH的釋放，減少氧化損傷。

Caspase蛋白家族在通常情況下以沒有活性的酶原方式存在于細胞內(nèi)，在受到凋亡信號刺激后可被激活。激活途徑有兩種，一種是死亡受體途徑，一種是線粒體途徑，死亡受體途徑主要是通過細胞之間的死亡配基之間的結(jié)合引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，線粒體途徑是以線粒體為核心激活細胞凋亡，誘導(dǎo)Bax的表達，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終促進細胞凋亡發(fā)生[17,18]。Caspase-3和Caspase-9分別為Caspase凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子和起始因子，在缺氧復(fù)氧心肌細胞中過度激活[19,20]。本實驗的結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧可以通過Caspase-3、Caspase-9激活和促進Bax表達誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而敲低HMGB1可以通過降低Caspase-3、Caspase-9的活化水平和抑制Bax的表達減少細胞凋亡的發(fā)生。

綜上，缺氧復(fù)氧后的心肌細胞中HMGB1合成和分泌水平升高，而敲低HMGB1可以減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化損傷，減少Caspase-3、Caspase-9、Bax介導(dǎo)的細胞凋亡的發(fā)生，對于HMGB1在原代心肌細胞和其他心肌細胞株中的作用仍然需要在后續(xù)實驗中進行驗證。本研究結(jié)果明確了HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細胞氧化損傷和細胞凋亡中的作用，缺氧復(fù)氧心肌損傷發(fā)病機制較為復(fù)雜，以后會繼續(xù)探討HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌損傷炎癥反應(yīng)和鈣離子超載中的作用。