王強(qiáng)厚 陶妍 崔旭 顏倩倩 張亞莉

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是一種能夠水解致病菌中黏性多糖的堿性酶，被認(rèn)為是體內(nèi)免疫保護(hù)系統(tǒng)的必要組成成分；也是甲殼動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的重要組分，在其免疫防御中發(fā)揮重要作用［1-2］。溶菌酶通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵而使細(xì)胞壁破裂，進(jìn)而致死細(xì)菌。溶菌酶主要分為6種類型：C型（Chicken-type）溶菌酶、G型（Goose-type）溶菌酶、無(wú)脊椎動(dòng)物型溶菌酶、植物溶菌酶、真菌和細(xì)菌溶菌酶、T4噬菌體溶菌酶［3］。其中C型溶菌酶已經(jīng)在昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)［4-5］，此外，在甲殼動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)有 C 型溶菌酶［6-7］。

目前，就水產(chǎn)生物而言，在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［8］、 中 國(guó) 明 對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）［9］和 凡 納 濱 對(duì) 蝦（Litopenaeus vannamei）［10］等無(wú)脊椎動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)存在C型溶菌酶基因；同時(shí)，在斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［11］、 虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）［12］、點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）和赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）［13-14］等硬骨魚中也發(fā)現(xiàn)了C型溶菌酶基因。迄今為止，關(guān)于水產(chǎn)生物來(lái)源的C型溶菌酶在原核細(xì)胞中表達(dá)的研究報(bào)道較多，例如，日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）［15］、仿刺參（Apostichopus japonicus）［16］、赤點(diǎn)石斑魚［14］和斑點(diǎn)叉尾鮰［17］的C 型溶菌酶已經(jīng)在大腸桿菌中得到表達(dá)；張輝等［8］報(bào)道了三疣梭子蟹C型溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）均有一定的抑菌作用。

然而，原核表達(dá)系統(tǒng)存在眾所周知的缺點(diǎn)，如對(duì)表達(dá)產(chǎn)物不能進(jìn)行翻譯后加工修飾，以致表達(dá)的目的蛋白會(huì)形成不溶性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為真核表達(dá)的宿主，其有助于表達(dá)產(chǎn)物空間構(gòu)象的形成，進(jìn)而獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白，并可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的細(xì)胞外分泌表達(dá)以方便表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)處理，是目前公認(rèn)的外源蛋白表達(dá)的良好宿主［18］。

近幾年來(lái)，我們先后開(kāi)展了對(duì)于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［19］、大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossusL.）［20］、斑點(diǎn)叉尾鮰［21-24］和斑馬魚（Danio rerio）［25］等數(shù)種魚類中不同抗菌肽的重組DNA表達(dá)研究；另一方面，以甲殼動(dòng)物三疣梭子蟹為研究對(duì)象，對(duì)其PtCrustin 2和PtCrustin 3抗菌肽實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)［26-27］。在上述研究的基礎(chǔ)上，最近我們聚焦于魚類來(lái)源溶菌酶的真核表達(dá)研究，已經(jīng)對(duì)鯉魚（Cyprinus carpio）g型溶菌酶基因進(jìn)行了cDNA克隆，并通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組g型溶菌酶［28］。此外，來(lái)自斑點(diǎn)叉尾鮰的C型溶菌酶基因也被克隆，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的表達(dá)，重組C型溶菌酶顯示了對(duì)于枯草牙孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性［29］。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）廣泛分布于日本沿海、韓國(guó)和中國(guó)等國(guó)家，是一種重要的商業(yè)蟹。目前，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，由細(xì)菌、真菌和病毒等引起的各種病害給三疣梭子蟹的養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的損失，由此造成抗生素的濫用也埋下了食品安全的隱患。因此，尋求一種替代或部分替代抗生素的天然免疫因子成為從源頭解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。據(jù)此，本研究以三疣梭子蟹C型溶菌酶基因作為重組DNA表達(dá)的目標(biāo)，以期通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得具有良好抑菌活性的三疣梭子蟹重組C型溶菌酶，為開(kāi)發(fā)用于三疣梭子蟹安全養(yǎng)殖的天然抑菌劑提供技術(shù)途徑。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，首先通過(guò)RT-PCR從其鰓中分離編碼C型溶菌酶的cDNA片段，以pPICZαA為表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33后，通過(guò)博來(lái)霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并采用固化金屬離子親和層析（IMAC）和MALDI-TOF/TOF分別對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和鑒定，最終通過(guò)平板涂布法和瓊脂糖擴(kuò)散法檢驗(yàn)三疣梭子蟹重組C型溶菌酶的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 克隆載體pMD-19T simple購(gòu)自TaKaRa公司（日本）；畢赤酵母X-33和表達(dá)載體pPICZαA購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生物科技有限公司（北京）；用于抑菌活性測(cè)定的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽胞桿菌、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和沙門氏菌（Salmonella lignieres）均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（XhoI、XbaI、SacI）和T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司（英國(guó)）；YNB（無(wú)機(jī)氮原）購(gòu)自 BIOSHARP公司（美國(guó)）；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA割膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒等購(gòu)自天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司（北京）；Western Blot 分析試劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京）。

1.1.3 儀器 實(shí)驗(yàn)所用儀器及型號(hào)如下：恒溫培養(yǎng)箱（XMT-A7000）、恒溫?fù)u床（ZHWY-200H），高速冷凍離心機(jī)（CT14RD）、恒溫孵育器（Eppendorf，Thermostat plus）、PCR 儀（BIO-RAD，PTC-200）、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（BIO-RAD，Power Pac Basic）、電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD，Gene Pulser Xcell）、蛋白質(zhì)純化儀（BIO-RAD，Profinia Protein Purification System）、賽多利斯切向回流超濾器（VIVAFLOW200）、酶標(biāo)儀（BioTek SLFPTAD）。引物合成和DNA測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 參考三疣梭子蟹C型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：FJ589729），設(shè)計(jì)用于PCR的引物（表1）；以實(shí)驗(yàn)室原有的三疣梭子蟹鰓的第一股cDNA為模板［26］，通過(guò)3次PCR（圖1），擴(kuò)增含XhoI、XbaI酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽的三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽基因“ptlyC”。第一次PCR的反應(yīng)體系和條件：10×TaqPlus Buffer 1 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、F1 和 R1（10 mol/L）各0.2 μL、模板 0.3 μL、TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.1μL、dd H2O 7.4 μL；94℃ 3 min、94℃ 40 s、57℃ 30 s、72℃1 min、72℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)。第二次PCR：以第一次PCR產(chǎn)物為模板、F2和R2為引物，反應(yīng)體系和條件同上，除了退火溫度改為54.5℃。第三次PCR：以第二次PCR 產(chǎn)物為模板、F3和R2為引物，反應(yīng)體系和條件同第二次PCR。將第3次PCR產(chǎn)物“ptlyC”割膠純化后與質(zhì)粒pMD-19T連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)菌落PCR挑取陽(yáng)性克隆，由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因的策略圖

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 使用XhoI和XbaI對(duì)重組克隆質(zhì)粒“pMD-19T-ptlyC”進(jìn)行雙酶切，獲得目的片段“ptlyC”；在T4DNA連接酶作用下，將其與被同樣酶處理過(guò)的表達(dá)載體pPICZαA連接（16℃，30 min），轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體pPICZαA-ptlyC是否構(gòu)建成功。

1.2.3 pPICZαA-ptlyC的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選 重組表達(dá)載體“pPICZαA-ptlyC”經(jīng)SacI酶切后，與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混合（1∶8，V/V），轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，1.5 kV、25μF、200 Ω，電擊5 ms，立即加入預(yù)冷的1 mol/L山梨醇；30℃孵育2 h后，離心將菌體涂布于含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%瓊脂粉和2%葡萄糖）上，29℃培養(yǎng)3 d；挑取部分菌落分別接種在含500 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板上，篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。同時(shí)，將挑取的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)接至MM平板（YNB13.4 g/L、甲醇5 mL/L、生物素0.4 mg/L、瓊脂15 g/L）上以篩選甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子提取基因組 DNA，采用通用引物5′AOX1和3′AOX1（表1）進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取一個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，取500μL轉(zhuǎn)接至50 mL BMGY培養(yǎng)基（酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、34% YNB 5 mL、10%甘油5 mL、0.02%生物素100 μL、1 mol/L磷酸鉀緩沖液5 mL）培養(yǎng)至OD600為2-6，離心收集菌體，重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基（酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、34%YNB 5 mL、1% 甲 醇 500 μL、0.02% 生 物 素 100 μL、1 mol/L 磷酸鉀緩沖液5 mL）中，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%。培養(yǎng)條件：pH6.0、28℃、250 r/min、72 h。每隔12 h收集培養(yǎng)液用于Tricine-SDS-PAGE分析（5%濃縮膠、12%分離膠、0.1 mol/L Tricine）。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化及Western blot分析 挑取1個(gè)良好的酵母轉(zhuǎn)化子，對(duì)其進(jìn)行1 000 mL的擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)條件同上，培養(yǎng)液經(jīng)離心（11 000 r/min，15 min）后，收集上清過(guò)0.22 μm濾膜，通過(guò)切向回流超濾器對(duì)其進(jìn)行超濾濃縮；濃縮液上蛋白質(zhì)純化儀，根據(jù)儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。純化產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDSPAGE 分析后，將凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF膜上（100 V，恒壓1 h）；用TBST漂洗后加入封閉液封閉1 h；再用TBST漂洗后加入抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫孵育2 h；再用TBST漂洗后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h；最后用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.6 目的蛋白的抑菌活性測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌分別與營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合（1∶1 000，V/V）倒平板，凝固后打直徑為6 mm的孔，加入100 μL純化的重組ptlyC，37℃培養(yǎng)12 h，觀察有無(wú)抑菌圈；同時(shí)，以100 μL洗脫緩沖液作為陰性對(duì)照。另一方面，取100 μL含重組ptlyC的培養(yǎng)液上清與1 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌混合，37℃振蕩培養(yǎng)2 h后，取30 μL涂布于YPD平板上，37℃培養(yǎng)12 h，觀察抑菌效果。同時(shí)，以100 μL含空質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 基于PCR擴(kuò)增的ptlyC基因及其cDNA序列

第一次PCR以三疣梭子蟹鰓的第一股cDNA為模板、F1和R1為引物，獲得645 bp的編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA（圖2泳道1）。第2次PCR以該全長(zhǎng)cDNA為模板、F2和R2為引物，獲得652 bp的5′端含6×His標(biāo)簽、3′端含終止密碼子TAG和XbaI位點(diǎn)的片段（圖2泳道2）。第3次PCR以該片段為模板、F3和R2為引物，擴(kuò)增到657 bp 的5′端含XhoI位點(diǎn)和Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)、3′端含終止密碼子TAG和XbaI位點(diǎn)的編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽的目的片段“ptlyC”（圖2泳道 3）。

對(duì)目的片段的測(cè)序結(jié)果（圖3-A）顯示，除在5′和3’ 端添加的相關(guān)位點(diǎn)和標(biāo)簽外，ptlyC編碼了由205個(gè)氨基酸殘基組成的三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽；8個(gè)保守的半胱氨酸殘基和活性位點(diǎn)的2個(gè)殘基（谷氨酸和天冬氨酸）位于成熟肽中。

圖2 三次PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 pPICZαA-ptlyC的鑒定和甲醇利用型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達(dá)載體pPICZαA-ptlyC的構(gòu)建如圖3-B所示。采用XhoI和XbaI對(duì)其進(jìn)行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在接近理論分子量657 bp處有一個(gè)明顯的條帶（圖4）；此外，DNA測(cè)序結(jié)果也證明ptlyC與pPICZαA正確連接。

圖3 目的基因ptlyC的核苷酸及其推斷的氨基酸序列（A）和重組表達(dá)載體的構(gòu)建（B）

圖4 重組表達(dá)載體pPICZαA-ptlyC的雙酶切驗(yàn)證

上述pPICZαA-ptlyC電轉(zhuǎn)至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)含500 μg/mL博來(lái)霉素的YPD和MM平板篩選，得到9株長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母轉(zhuǎn)化子；以它們的基因組DNA為模板，采用載體上醇氧化酶AOX1基因的通用引物5′AOX1和3′ AOX1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖5）顯示：9株酵母菌均在1 153 bp和近2 000 bp處有明顯條帶，前者為預(yù)期的理論分子量位置，證明目的基因ptlyC被成功嵌合進(jìn)pPICZαA載體；后者為畢赤酵母X-33基因組中也存在醇氧化酶AOX1基因的該兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)而擴(kuò)增的條帶。但含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子（陰性對(duì)照）則未見(jiàn)此條帶。

2.3 重組ptlyC的表達(dá)和純化及其鑒定

挑取篩選到的高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子（圖5，泳道9）于50 mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖6 Tricine-SDS-PAGE分析所示，隨著表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液上清所顯示的在理論分子量25.3 kD處的條帶逐漸加深，至72 h時(shí)最為明顯；而含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清中未發(fā)現(xiàn)該分子量的條帶。此結(jié)果初步證明重組ptlyC在畢赤酵母X-33中得到成功表達(dá)。

圖5 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

圖6 培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析

進(jìn)一步對(duì)上述菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液上清進(jìn)行IMAC法純化，得到的純化產(chǎn)物經(jīng)Western blot分析顯示（圖7），在近27 kD處有明顯條帶，證明該純化產(chǎn)物與抗His的鼠單克隆抗體成功雜交；經(jīng)BCA法測(cè)定，純化產(chǎn)物的濃度為0.21 mg/mL。由于在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中蛋白質(zhì)條帶可能會(huì)發(fā)生偏移，以致條帶的位置稍偏高。而陰性對(duì)照則未見(jiàn)任何條帶。Western blot的分析結(jié)果進(jìn)一步證明了重組ptlyC在畢赤酵母X-33中得到成功表達(dá)。

2.4 重組ptlyC的抑菌活性

通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法考察含重組ptlyC的培養(yǎng)液上清對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性，結(jié)果如圖8-A所示，濃縮30倍的培養(yǎng)液上清（總蛋白質(zhì)濃度1.9 mg/mL）顯示了對(duì)枯草芽孢桿菌的明顯的抑菌活性。

圖7 純化產(chǎn)物的Western blot分析

圖8 含重組ptlyC的培養(yǎng)液上清（A）和純化的ptlyC（B）的抑菌活性

另一方面，通過(guò)瓊脂糖凝膠擴(kuò)散法考察了純化后的重組ptlyC的抑菌活性，結(jié)果如圖8-B所示，分別涂有枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的平板上的孔經(jīng)純化后的重組ptlyC處理后，均顯示了明顯的抑菌圈；涂有沙門氏菌的平板雖然菌落分布密集，但亦可辨明有依稀可見(jiàn)的抑菌圈；而用洗脫緩沖液處理的孔則無(wú)明顯的抑菌圈，由此證明重組ptlyC具有良好的抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的活性。

3 討論

本研究通過(guò)RT-PCR獲得編碼三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽的cDNA片段“ptlyC”，并成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-ptlyC，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33后，在誘導(dǎo)表達(dá)階段，分別使用了以YNB（無(wú)機(jī)氮）作為氮源的BMM培養(yǎng)基（結(jié)果未顯示）和有機(jī)氮（酵母粉和蛋白胨）作為氮源的BMMY培養(yǎng)基，結(jié)果顯示基于BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體的長(zhǎng)勢(shì)及重組蛋白的表達(dá)情況更好，因此在后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)中使用BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。然而，根據(jù)純化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度估算得到的重組ptlyC的表達(dá)量低于1 mg/L，導(dǎo)致如此低的表達(dá)量的原因可能與本研究使用的天然cDNA有關(guān)，經(jīng)JAVA Codon Adaption Tool（http://www.jcat.de/Start.jsp）檢測(cè)，“ptlyC”基因中有80個(gè)屬于低頻密碼子（相對(duì)適應(yīng)性低于0.1）。李兵等［30］報(bào)道了經(jīng)密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中表達(dá)的重組體黑曲霉阿魏酸酯酶活性較天然cDNA表達(dá)的重組蛋白提高了近6倍；Inouye等［31］的研究表明根據(jù)人類密碼子偏愛(ài)性對(duì)螢火蟲熒光素酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，顯著提高了其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平。因此，進(jìn)一步的研究將聚焦于對(duì)“ptlyC”基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的重組DNA表達(dá)。

為方便純化和Western blot分析，本研究設(shè)計(jì)的重組蛋白在其N端含6×His標(biāo)簽，但無(wú)論含重組ptlyC的培養(yǎng)液上清還是純化的重組ptlyC均顯示了抑菌活性，說(shuō)明N端的6×His標(biāo)簽并不影響重組蛋白的生物學(xué)活性；此結(jié)果與舒正玉［32］報(bào)道的黑曲霉F044脂肪酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母GS115中表達(dá)的結(jié)果是一致的，他同樣設(shè)計(jì)了N端含6×His標(biāo)簽的重組蛋白，經(jīng)大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)的重組F044脂肪酶均具有較高的酶活力。值得注意的是，純化的重組ptlyC除了顯示對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的枯草芽孢桿菌有抑菌活性之外，還對(duì)革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌具有較明顯的抑菌活性；張輝等［8］報(bào)道的通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組三疣梭子蟹C型溶菌酶則具有抑制革蘭氏陰性的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和鰻弧菌的活性。而馮亞?wèn)|等［29］報(bào)道的通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組斑點(diǎn)叉尾鮰C型溶菌酶僅顯示對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑菌活性。三疣梭子蟹與魚類在C型溶菌酶抑菌譜方面的差異可能源于兩者來(lái)源的C型溶菌酶在結(jié)構(gòu)上的差異，這種差異與兩者分屬不同的物種有關(guān)，前者為甲殼類動(dòng)物，而后者屬于硬骨魚類，它們?cè)诿庖邫C(jī)制方面存在的客觀差異可能導(dǎo)致作為免疫因子的C型溶菌酶在結(jié)構(gòu)和功能上的差異。該方面的研究工作還有待于進(jìn)一步深入。本研究建立的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)甲殼動(dòng)物來(lái)源的天然抗菌劑奠定了重要的研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究建立了基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三疣梭子蟹C型溶菌酶的制備方法，其最適的表達(dá)條件為：在BMMY培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min、pH6.0、1%甲醇，培養(yǎng)72 h。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，重組ptlyC的分子量接近預(yù)期的理論分子量（25.3 kD）。抑菌實(shí)驗(yàn)證明，重組三疣梭子蟹C型溶菌酶具有抑制革蘭氏陽(yáng)性的枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的活性。