任天雷 楊海泉 許菲

（江南大學生物工程學院 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122）

隨著有機磷農(nóng)藥長久和廣泛的使用，不僅污染了土壤和水源，破壞自然界的生態(tài)系統(tǒng)平衡，同時大量的殘留在瓜果蔬菜及動物性食品上的有機磷農(nóng)藥對人體產(chǎn)生很多不良的影響［1］。有機磷降解酶是一種高效，低毒，無殘留的生物綠色催化劑，是消除農(nóng)藥殘留最有潛力的新方法［2］。

由于甲基對硫磷水解酶可水解最常見有機磷農(nóng)藥之一，甲基對硫磷，這使該酶成為生物降解領域的主要研究對象。本實驗所關(guān)注的甲基對硫磷水解酶 MPH 源于Pseudomonassp.WBC-3［3］。通過對MPH晶體結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)［4］，MPH是一種金屬酶，在催化活性中心具有含有兩個二價金屬離子，并通過活性中心內(nèi)部的關(guān)鍵殘基His147、His149、Asp151、His152、His234、His302和Asp255催化底物的水解。但是MPH水解效率較低，如何提高該酶的催化效率是本項研究的核心問題。

目前對酶的改造策略多種多樣，例如，定向進化［5-7］、計算機輔助設計［8-10］、酶的全新設計［11-13］等，但是酶活性中心均為改造的關(guān)鍵區(qū)域。酶的活性中心有底物結(jié)合和提供反應基團的關(guān)鍵殘基。在引入新的催化活性或改變酶的專一性方面，靠近活性中心的位置突變所產(chǎn)生的影響明顯高于遠離活性中心的位置［14］?；钚灾行母浇暮芏辔稽c都是高保守性的。蛋白質(zhì)的高保守序列是在中性進化的過程中極少積累突變的序列［15］，而且高保守序列往往是蛋白質(zhì)的功能區(qū)域［16-18］，一旦高保守序列發(fā)生突變極有可能導致蛋白質(zhì)的功能喪失。而低保守的序列經(jīng)過高頻率的突變和正向的選擇很有可能出現(xiàn)有利的突變［15］，因此選擇低保守序列進行高通量篩選更能提高定向進化的效率。本實驗利用酶的分子結(jié)構(gòu)信息，計算距離活性中心較近的位點；并結(jié)合每個殘基的生物信息學進化保守性［19］，進一步限定突變區(qū)域的范圍，提高了正向突變株的篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）BL21以及pET-28a質(zhì)粒購于Novagen公司。含有甲基對硫磷水解酶基因的重組質(zhì)粒pET-28a-mpd由本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 甲基對硫磷購自AccuStandard公司。PCR所用的酶購自TaKaRa的HS PrimeSTAR。測定蛋白質(zhì)濃度的試劑為碧云天公司生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 文庫的構(gòu)建與篩選 定點飽和突變以pET-28a-mpd為模板，利用軟件Primer 5.0設計簡并引物進行定點飽和突變，簡并引物如表1。

表1 定點飽和突變引物

PCR體系 ：5× GXL loading buffter 10 μL；dNTP 4 μL；上下游引物各 1 μL；模板（10 ng/ μL）0.5 μL ；GXL polymerase 1 μL；加入無菌水至 50 μL。PCR條件為：95℃ 3 min；98℃ 10 s；55℃ 15 s；68℃ 1 kb/min；68℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后，使用DpnI酶消除模板。之后采用T4 Polynucleotide Kinase試劑盒進行磷酸化，加入T4連接酶使重組載體自連。轉(zhuǎn)化至E. coliBL21感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并測序，突變率在75%以上即可使用。

據(jù)公式Pi=100［1-exp（-T×Fi）］［20］，Pi是某一突變點i突變體的覆蓋率，T是需要挑選的克隆子，F(xiàn)i是某一突變點i在文庫中出現(xiàn)的頻率。在引物中NNK，F(xiàn)i=1/4×1/4×1/2=1/32，當覆蓋率達到94%時需要挑88個陽性克隆子。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接入每孔含有400 μL TB液體培養(yǎng)基的96深孔培養(yǎng)板，同時預留兩個孔作為對照，一孔接入野生酶重組菌株，一孔不接入任何菌株。37℃，800 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8時，每孔再加入4 μL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），25℃誘導12 h。發(fā)酵結(jié)束后，每孔加入10 mg/mL 的溶菌酶37℃處理2 h，凍融一次。4 800 r/min，10 min離心。吸取2 μL上清液至96微孔板中，其中每孔加入190 μL Tris-HCl緩沖液（含250 μmol/L的甲基對硫磷），37℃反應5 min。測定吸光值A405，篩選酶活力較高的菌株并保藏。對初篩的菌株進行進一步的復篩，搖瓶誘導表達、純化、測定其比酶活力。

1.2.2 MPH及其突變體表達純化 從保藏管中轉(zhuǎn)接50 μL的突變體菌株至含有20 mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h。按1%的接種量接種至含有100 mL TB培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8。按1%的添加量加入IPTG，25℃、200 r/min誘導表達24 h。離心獲得菌體，破壁。使用鎳柱親和純化，分別用60 μmol/L和75 μmol/L 濃度的咪唑進行洗雜，再用100 μmol/L濃度的咪唑沖洗獲得目的蛋白。

1.2.3 酶活力測定 酶活力單位定義：在一定條件下，酶催化甲基對硫磷（MP）每分鐘釋放出1 μmol無機磷所需要的酶量為一個酶活力單位（U）［21］。

酶活測定方法：在96微孔板中依次加入20 μL酶 液，180 μL含 有 125 μmol/L MP的 Tris-HCl（20mmol/L、pH8.0）緩沖液，立即將96微孔板放入多功能酶標儀中進行測量。MPH水解甲基對硫磷的產(chǎn)物對硝基苯酚，在波長405 nm有最大的吸收值，檢測波長設為405 nm，溫度設置37℃，每隔15 s讀取一次數(shù)據(jù)。選取酶的一級反應的階段，計算酶活。

1.2.4 動力學參數(shù)的測定 取20 μL樣品至96微孔板，之后吸取180 μL含不同MP濃度的Tris-HCl緩沖液［22］（20 μmol/L、pH8.0），混合溶液中底物濃度范圍為 30 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100μmol/L和125 μmol/L。在37℃，測定酶的反應過程。選定酶反應的一級階段繪制雙倒數(shù)曲線，通過米氏方程求得動力學參數(shù)。

1.2.5 最適反應pH和最適反應溫度的測定 在pH5.0-12.0范圍內(nèi)測到酶的最適pH值，不同pH值對應的緩沖液（20 μmol/L）為：pH5.0-6.0乙酸鈉-HCl緩 沖液、pH6.0-9.0 Tris-HCl緩 沖 液、pH9.0-12.0甘氨酸-NaOH緩沖液。測到酶的最適反應溫度時，不同溫度分別為 30、35、40、45、50、55、60和65℃，其他條件均與酶活測到方法一致。

2 結(jié)果

2.1 突變位點的確定

利用MPH的結(jié)構(gòu)信息（PDB：1P9E），催化活性中心具有含有兩個二價金屬離子，并通過活性中心內(nèi)部的關(guān)鍵殘基His147、His149、Asp151、His152、His234、His302、Asp255催化底物的水解（圖1-B）。首先根據(jù)活性中心兩個金屬離子的坐標，計算出兩個金屬離子中心點的坐標，中心點的坐標為1.899、40.1325、25.138。

通過軟件EVcoupling計算出在進化中每個殘基的保守性分數(shù)［20］，選取保守性低于40%的氨基酸殘基作為定點飽和突變的位點：Val97、Met148、Pro150、Phe196、Leu256、Ile257、Leu258、Leu273和Ser301等9個位點（表 2）。

2.2 突變文庫的構(gòu)建及篩選

以pET-28a-mpd為模板，采用引物（表1）進行擴增。PCR擴增片段為整個重組質(zhì)粒，mpd片段長度996 bp，pET-28a片段長度5 369 bp，PCR擴增目的片段長度約6.3 kb。圖2中片段大小與理論值一致，并通過測序驗證正確。

根據(jù)公式，當覆蓋率達到94%時需要挑88個陽性克隆子。從構(gòu)建的突變體文庫中隨機挑選10個克隆進行測序，其突變率為70%以上則可使用。為了確保其堿基覆蓋率，每個突變位點挑取150株克隆子進行初篩。經(jīng)過第一輪的初篩，從1 500株中得到38株正向突變（圖 3）。

為了進一步準確測定MPH突變體的催化效率，需要獲得比較純的酶蛋白。通過IPTG誘導、超聲波破碎、離心、鎳柱純化得到MPH及其突變體較純的目的蛋白。MPH理論分子量為32.3 kD，本實驗純化所得目的蛋白在29.0 kD和44.3 kD之間有一條清晰的條帶（圖4）。通過與對照比較，確定純化獲得的蛋白為目的蛋白。

圖1 甲基對硫磷水解酶的三維結(jié)構(gòu)圖（1P9E）

表2 位點距離活性中心的距離及其保守性

圖2 全質(zhì)粒定點突變PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3 MPH突變體文庫的初篩

圖4 純化后MPH及其突變體的SDS-PAGE圖譜

經(jīng)過復篩，從初篩得到的38株中篩選到了2株比酶活力明顯提高，分別是L258V和L273M。L258V、L273M的比酶活力分別是19.8 U/mg 和21.1 U/mg，而野生型MPH的比酶活力為14.13 U/mg。L258V、L273M的比酶活力分別較野生型分別提高了1.4和1.5倍（圖5）。

圖5 MPH突變體文庫的復篩

2.3 MPH及其突變體的酶學性質(zhì)分析

2.3.1 L258V突變和L273M突變對MPH的最適反應pH和最適反應溫度的影響 與野生型MPH相比，突變體的最適反應pH發(fā)生了一定的變化（圖6-A）。當pH＜10.0時，野生型MPH的酶活一直呈上升趨勢。到達最高值之后開始緩慢下降，pH8.0-12.0時，酶活均較高，說明該酶在堿性條件具有較高酶活性。突變后，突變體L258V的最適反應pH由野生酶的10.0升高至11.0，突變體呈現(xiàn)了更偏堿的趨勢。但突變體L273M的最適反應pH由野生酶的10.0降低至9.0，說明該突變促使酶在酸性條件下具有更高的酶活。

如圖6-B所示，L258V和L273M突變對MPH的最適反應溫度沒有影響。野生型MPH的最適反應溫度為40℃，當反應溫度為30-40℃時，野生型MPH的酶活呈快速上升趨勢，但當溫度高于45℃時，酶活開始下降。突變后，突變體L258V和L273M的最適反應溫度均為40℃，與野生酶相比較沒有變化。

2.3.2 L258V突變和L273M突變對MPH的動力學參數(shù)的影響 測定了相同蛋白濃度下野生型MPH及兩個突變體以甲基對硫磷為底物的反映過程曲線（圖7）。與野生型相比，突變體L258V和L273M的初始反應速率有了顯著的提高，分別提高了48.9%和58.1%。

MPH突變體L258V和L273M的催化效率相比野生型有明顯的提高。野生型MPH的kcat/Km值是105.3（mmol/L）-1·s-1，L258V 和 L273M 的kcat/Km值分別是 134.1（mmol/L）-1·s-1和 166.5（mmol/L）-1·s-1，這兩個突變體的催化效率kcat/Km值分別提高了27.3%和58.1%（表3，表4）。

圖6 L258V突變和L273M突變對MPH的最適反應pH（A）和最適反應溫度（B）的影響

圖7 野生型MPH及其突變體反應過程曲線

3 討論

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，按照人類的需要對酶進行分子改造成為大家關(guān)注的熱點。Arnold［23］在20世紀90年代年初期提出了定向進化的概念，定向進化技術(shù)由于簡單易行，是目前最廣泛應用的酶改造方法。但此方法需要構(gòu)建龐大的突變體文庫進行篩選，且只有極少數(shù)的突變體是有益的突變，因此其工作效率較低。理性設計需要對酶的晶體結(jié)構(gòu)和催化機理有深入的了解，對改造前期工作要求很高。雖然理性設計和非理性設計（定向進化）都可以有效的改變酶的性能，但是兩者結(jié)合起來改變酶的特性將代表著未來的發(fā)展方向［24］。

表3 野生型MPH及其突變體對甲基對硫磷的動力學參數(shù)

表4a 野生型MPH及其突變體對甲基對硫磷的動力學參數(shù)

本研究通過基于甲基對硫磷水解酶的分子結(jié)構(gòu)及其生物信息學等多維度特征的定向進化，篩選得到兩株催化效率明顯提高的突變體L258V和L273M。由于甲基對硫磷水解酶的活性中心處于疏水環(huán)境中，周圍被7個疏水殘基包圍。包括：Leu65、Leu67、Phe119、Trp179、Phe196、Leu258和Leu273。Dong［4］使用低溫保護劑甘油分子與MPH 建模，發(fā)現(xiàn)甘油分子與金屬活性中心周圍的疏水殘基構(gòu)成疏水接觸，說明這些疏水殘基可能對底物構(gòu)成空間位阻或與底物形成氫鍵，在底物與酶結(jié)合時限定底物取向，進而影響酶與底物結(jié)合的方式以及反應方式。L258V和L273M是構(gòu)成活性中心口袋的一部分且距離酶的活性中心較近（圖1-A），因此推測其突變對催化活性中心區(qū)域產(chǎn)生輕微的影響，進而影響酶與底物的反應，促使其催化效率提高。

隨著蛋白質(zhì)測序技術(shù)不斷發(fā)展，在數(shù)據(jù)庫中已積累了大量蛋白質(zhì)同源序列的大數(shù)據(jù)?；诜肿舆M化理論，利用生物信息學手段分析同源序列，限定酶的改造位點，縮小篩選范圍，是酶工程的新思路。同時增加了我們對于酶的關(guān)鍵位點的進一步理解，對以后酶的工程改造和對數(shù)據(jù)庫中的新的蛋白序列的功能預測提供一些參考。

4 結(jié)論

通過計算活性中心附近的位點并進行同源序列比對，選取距離活性中心8 ?以內(nèi)的9個低保守性位點進行定向進化。經(jīng)過兩輪篩選，從1500株突變體中獲得2株催化效率明顯提高的突變體L258V和L273M。