蘇初連 康浩 梅志棟 楊石有 劉曉妹 蒲金基 張賀

（1海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101；3 澄邁縣農(nóng)業(yè)局，澄邁 571900）

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）廣泛分布在熱帶和亞熱帶區(qū)域，侵染芒果、香蕉、橡膠、荔枝等多種植物，引起葉部和果實(shí)炭疽病。病菌以分生孢子侵染寄主的嫩葉、嫩梢、花、果等部位，引起落葉、落花、落果，以及貯藏期的果實(shí)腐爛［1-2］。目前，防治芒果炭疽病的方法主要為化學(xué)防治，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量施用，許多地區(qū)的芒果炭疽病菌出現(xiàn)不同程度地耐藥性或抗藥性，如代森錳鋅在芒果園內(nèi)的長(zhǎng)期使用，增加了病原菌對(duì)藥劑的選擇壓［3-4］；丙環(huán)唑的長(zhǎng)期使用使眾多作物產(chǎn)生抗藥性［5］，多菌靈［6］、甲基硫菌靈［7］、苯醚甲環(huán)唑［8］、咪鮮胺［9］等農(nóng)藥也是如此。田間芒果炭疽病成為生產(chǎn)中較為難防治的病害之一，為更好地解決該問(wèn)題，有必要從分子水平上探究芒果炭疽病的致病機(jī)理，尋找新的農(nóng)藥靶標(biāo)位點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥提供參考。

通過(guò)分析病原菌侵染寄主過(guò)程中基因的差異表達(dá)，可以較好地辨析出致病相關(guān)基因在侵染過(guò)程中的作用［10-12］。膠孢炭疽菌致病相關(guān)基因主要調(diào)控孢子萌發(fā)，附著胞的形成、黑化、穿透，活體與死體營(yíng)養(yǎng)階段的轉(zhuǎn)換及相關(guān)蛋白分泌，酶活性及產(chǎn)孢等。如，漆酶基因LAC1在菌絲生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、黑色素沉淀，以及分生孢子的形成，對(duì)寄主的致病力、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力等方面起著重要的調(diào)控作用［13］。

本實(shí)驗(yàn)以芒果炭疽病菌的PL（果膠裂解酶，Pectase Lyase）、PG（ 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶，Endopolygalacturonas-F）、ECH（烯酰-coA水合酶/異構(gòu) 酶 蛋 白，EnoyL-coA-hydratase/isomerase-F）、LIP（分泌脂肪酶，Secretory lipase-F）、PKS（聚酮合成酶，Polyketide synthase-F）、SCD（小柱孢酮脫水酶，Scytalone dehydratase）、CRAT（肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，Carnitine acetyl transferase-F）、HMT（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，Histone methyltransferase）、SIN3P（組蛋白脫乙酰酶，Histone deacetylase）、NRPS（非核糖體多肽合成酶，Nonribosomal peptide synthetase-F）和MEP2（銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mep2，Ammonium transporter mep2-F）等11個(gè)致病相關(guān)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析致病相關(guān)基因在病原菌侵染葉片和果實(shí)過(guò)程中的表達(dá)量變化，揭示芒果炭疽病菌侵染過(guò)程中致病相關(guān)基因的差異表達(dá)，辨析出各個(gè)侵染階段的致病相關(guān)基因，旨在為后續(xù)基因功能解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芒果炭疽病菌由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)植所提供。供試材料貴妃芒的嫩葉和成熟果，采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品資所芒果苗圃。

E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit 購(gòu)于 Omega 生物技術(shù)公司、熒光定量PCR試劑盒UltraSYBR Mixture（Low Roe）購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于天根生化科技有限公司，其它試劑均為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 病原菌接種葉片和果實(shí) 參考張賀等［14］人的方法制備芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）A2的分生孢子懸浮液，使其濃度為4×106個(gè)/mL，用于接種芒果嫩葉和成熟果。

用清水將貴妃芒的嫩葉、成熟果實(shí)沖洗干凈，然后浸泡在1% NaClO溶液中15 min，再用超純水沖洗3遍后置于保鮮盒中，保持相對(duì)濕度為100%，備用。

采用束針刺傷嫩葉和成熟果實(shí)表皮，接種20 μL分生孢子懸浮液，28℃下恒溫黑暗培養(yǎng)，以接菌0 h的為對(duì)照。用直徑為1 cm的打孔器取10個(gè)接種點(diǎn)，按照不同的時(shí)間點(diǎn)取樣后至于液氮速凍、-80℃保存、備用。

接種葉片后的取樣時(shí)間點(diǎn)：0 h、6 h、12 h、24h、36 h、48 h、72 h；接種果實(shí)后的取樣時(shí)間點(diǎn)：0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 和 96 h。

1.2.2 病原菌總RNA的提取和cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄 參照E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit中的方法提取不同時(shí)間點(diǎn)的病原菌總RNA，參照Fast Quant RT Kit（with gDNase）試劑盒完成第一鏈cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，備用。采用超微量紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳兩者相結(jié)合的方法檢驗(yàn)總RNA的提取效果，確保RNA的提取質(zhì)量滿足實(shí)驗(yàn)需要。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以病原菌PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP211個(gè)致病相關(guān)基因?yàn)閷?duì)象，以ACT作為內(nèi)參基因，所用基因引物序列參考Alkan等［15］，由北京華大生物科技有限公司合成，PAGE純化，詳細(xì)引物序列見(jiàn)表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL， 引 物 各 0.5 μL，2×UltraSYBR Mixture 10 μL，檢測(cè)系統(tǒng)為 Quant Studio 6 Flex。

PCR反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃1 min，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；16℃保存，在72℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

表1 供試引物序列

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算［16］，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System Software）系統(tǒng)導(dǎo)出各樣品的Ct值，以接菌0 h的為對(duì)照，以基因表達(dá)量增加2倍以上為上調(diào)，降低50%為下調(diào)。參考Deng等［17］的方法，采用HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖，研究分析各致病相關(guān)基因在不同組織的侵染過(guò)程中的表達(dá)差異情況。

2 結(jié)果

2.1 病原菌侵染葉片時(shí)相關(guān)基因表達(dá)量分析

病原菌侵染嫩葉時(shí)，11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量差異明顯，PL、PG在整個(gè)侵染過(guò)程中持續(xù)高效表達(dá)、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量高于0 h的5倍以上，PKS、NRPS、MEP2、HMT、ECH、SDH、LIP和CRAT等8個(gè)基因在接種6 h 后明顯上調(diào)表達(dá)，隨后則不同程度地下調(diào)表達(dá)，僅CRAT在24 h時(shí)、HMT和LIP在72 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)2倍以上；SIN3P基因則持續(xù)下調(diào)表達(dá)（圖1）。

圖1 病原菌侵染葉片時(shí)基因差異表達(dá)的熱度圖

以病原菌侵染葉片時(shí)的不同基因不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量的兩兩差異程度進(jìn)行層級(jí)聚類分析，結(jié)果表明，11個(gè)基因共聚為3個(gè)大的分支，持續(xù)性高效表達(dá)的PG和PL基因聚為1個(gè)分支，表達(dá)量較低的SIN3P、PKS、NROS和ECH4個(gè)基因聚為一個(gè)分支，介于二者之間的其余5個(gè)基因聚為1個(gè)分支，這說(shuō)明表達(dá)量相近的基因會(huì)聚類在同一個(gè)分支上。

2.2 病原菌侵染果實(shí)時(shí)相關(guān)基因表達(dá)量分析

病原菌侵染成熟果時(shí)，11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量差異明顯，PL、PG、SDH和ECH基因高效表達(dá)、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量高于0 h的3倍以上，其他基因則有不同程度的上調(diào)表達(dá)（圖2）。

圖2 病原菌侵染果實(shí)時(shí)基因差異表達(dá)的熱度圖

以病原菌侵染果實(shí)時(shí)的不同基因不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量的兩兩差異程度進(jìn)行層級(jí)聚類，結(jié)果表明，11個(gè)基因共聚為2個(gè)大的分支5個(gè)小的分支，持續(xù)高效表達(dá)的PL、PG、SDH、ECH基因聚為1個(gè)大分支，其中PG和PL聚為1個(gè)小分支，ECH和SDH聚為1個(gè)小的分支，說(shuō)明4個(gè)基因雖持續(xù)上調(diào)表達(dá)，但仍有所差異；SIN3P和PKS基因分別單獨(dú)聚為一個(gè)小的分支，SIN3P僅在12 h和48 h是上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量分別為13.34和2.62倍，96 h為下調(diào)表達(dá)，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量介于1.10-1.89倍之間，PKS在12 h、24 h、48 h和72 h上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量分別為4.92、15.22、16.35和46.49倍，36 h的為0.68倍，96 h為下調(diào)表達(dá)。

3 討論

病原菌在侵染寄主的過(guò)程中，會(huì)調(diào)控自身的致病相關(guān)基因進(jìn)行高效表達(dá)，從而調(diào)控分生孢子或菌絲朝著有利于自身侵染的方向生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)病原菌的順利侵染，造成寄主感病。分析致病相關(guān)基因在侵染過(guò)程中的差異表達(dá)，可為揭示基因功能提供借鑒，也可為施加藥劑阻礙致病基因的高效表達(dá)、降低病原菌的侵染效率提供參考。Alkan等［15］在研究膠孢炭疽菌侵染番茄果實(shí)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶基因PG和果膠裂解酶基因PL在侵染過(guò)程中持續(xù)高效上調(diào)表達(dá)，這與本文研究發(fā)現(xiàn)芒果膠孢炭疽菌侵染葉片和果實(shí)時(shí)PG和PL持續(xù)性地高效上調(diào)表達(dá)，具有很好的一致性，這兩個(gè)基因能降解寄主細(xì)胞壁中的果膠，促使其成功地定殖于寄主內(nèi)，其單基因突變或雙基因突變均能明顯地降低病原菌的致病力［16］。ECH基因則是先上調(diào)再下調(diào)的表達(dá)方式［17］，與本文結(jié)果有差異；PKS基因在膠孢炭疽菌侵染番茄果實(shí)時(shí)為下調(diào)表達(dá)，而本實(shí)驗(yàn)中PKS基因的表達(dá)方式為先上調(diào)再下調(diào)表達(dá)，與Alkan等［18］的研究結(jié)果有所不同。

附著胞在膠孢炭疽菌的侵染過(guò)程中起到重要的作用，黑色素的合成積累能增加附著胞的膨壓，從而促進(jìn)病原菌的成功侵染，而小柱孢酮脫水酶SCD基因則是黑色素合成途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶之一［19-20］，該基因表達(dá)活性的強(qiáng)弱會(huì)影響到膠孢炭疽菌的侵染效率。本研究發(fā)現(xiàn)小柱孢酮脫水酶（SDH）在病原菌接種葉片6 h時(shí)、接種果實(shí)12 h是上調(diào)表達(dá)，而這個(gè)時(shí)期則是病原菌分生孢子侵染的時(shí)期［21］，這說(shuō)明小柱孢酮脫水酶SCD參與了分生孢子侵染寄主的過(guò)程中。氰菌胺（Fenxanil）和環(huán)丙酞菌胺（Carpropamid）［22-23］是以小柱孢酮脫水酶為靶標(biāo)的殺菌劑，通過(guò)阻斷脫水步驟而限制黑色素DHN的合成，從而抑制病原菌的侵染，但針對(duì)不同的病原菌，其殺菌效果差異較大，鑒于SDH在膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實(shí)種發(fā)揮重要作用，有必要對(duì)氰菌胺（Fenxanil）和環(huán)丙酞菌胺（Carpropamid）優(yōu)化，而得到殺菌效果更好的殺菌劑，應(yīng)用于芒果炭疽病的防治過(guò)程中。

4 結(jié)論

芒果膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實(shí)過(guò)程中，病原菌的PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP2等11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)明顯變化。病原菌侵染葉片時(shí)，PG和PL基因均持續(xù)高效表達(dá)，SIN3P基因表達(dá)較低，其余基因在侵染6 h時(shí)表達(dá)量較高，隨后下降；病原菌侵染果實(shí)時(shí)，PL、PG、SDH和ECH等基因高效表達(dá)，其余基因則有升有降。