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        芒果炭疽病菌侵染過(guò)程中致病基因的表達(dá)分析

        2018-11-07 08:58:46蘇初連康浩梅志棟楊石有劉曉妹蒲金基張賀
        生物技術(shù)通報(bào) 2018年10期
        關(guān)鍵詞:差異

        蘇初連 康浩 梅志棟 楊石有 劉曉妹 蒲金基 張賀

        (1海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,???570228;2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所,???571101;3 澄邁縣農(nóng)業(yè)局,澄邁 571900)

        膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)廣泛分布在熱帶和亞熱帶區(qū)域,侵染芒果、香蕉、橡膠、荔枝等多種植物,引起葉部和果實(shí)炭疽病。病菌以分生孢子侵染寄主的嫩葉、嫩梢、花、果等部位,引起落葉、落花、落果,以及貯藏期的果實(shí)腐爛[1-2]。目前,防治芒果炭疽病的方法主要為化學(xué)防治,但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量施用,許多地區(qū)的芒果炭疽病菌出現(xiàn)不同程度地耐藥性或抗藥性,如代森錳鋅在芒果園內(nèi)的長(zhǎng)期使用,增加了病原菌對(duì)藥劑的選擇壓[3-4];丙環(huán)唑的長(zhǎng)期使用使眾多作物產(chǎn)生抗藥性[5],多菌靈[6]、甲基硫菌靈[7]、苯醚甲環(huán)唑[8]、咪鮮胺[9]等農(nóng)藥也是如此。田間芒果炭疽病成為生產(chǎn)中較為難防治的病害之一,為更好地解決該問(wèn)題,有必要從分子水平上探究芒果炭疽病的致病機(jī)理,尋找新的農(nóng)藥靶標(biāo)位點(diǎn),為開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥提供參考。

        通過(guò)分析病原菌侵染寄主過(guò)程中基因的差異表達(dá),可以較好地辨析出致病相關(guān)基因在侵染過(guò)程中的作用[10-12]。膠孢炭疽菌致病相關(guān)基因主要調(diào)控孢子萌發(fā),附著胞的形成、黑化、穿透,活體與死體營(yíng)養(yǎng)階段的轉(zhuǎn)換及相關(guān)蛋白分泌,酶活性及產(chǎn)孢等。如,漆酶基因LAC1在菌絲生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、黑色素沉淀,以及分生孢子的形成,對(duì)寄主的致病力、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力等方面起著重要的調(diào)控作用[13]。

        本實(shí)驗(yàn)以芒果炭疽病菌的PL(果膠裂解酶,Pectase Lyase)、PG( 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶,Endopolygalacturonas-F)、ECH(烯酰-coA水合酶/異構(gòu) 酶 蛋 白,EnoyL-coA-hydratase/isomerase-F)、LIP(分泌脂肪酶,Secretory lipase-F)、PKS(聚酮合成酶,Polyketide synthase-F)、SCD(小柱孢酮脫水酶,Scytalone dehydratase)、CRAT(肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶,Carnitine acetyl transferase-F)、HMT(組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,Histone methyltransferase)、SIN3P(組蛋白脫乙酰酶,Histone deacetylase)、NRPS(非核糖體多肽合成酶,Nonribosomal peptide synthetase-F)和MEP2(銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mep2,Ammonium transporter mep2-F)等11個(gè)致病相關(guān)基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,分析致病相關(guān)基因在病原菌侵染葉片和果實(shí)過(guò)程中的表達(dá)量變化,揭示芒果炭疽病菌侵染過(guò)程中致病相關(guān)基因的差異表達(dá),辨析出各個(gè)侵染階段的致病相關(guān)基因,旨在為后續(xù)基因功能解析奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        供試芒果炭疽病菌由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)植所提供。供試材料貴妃芒的嫩葉和成熟果,采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品資所芒果苗圃。

        E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit 購(gòu)于 Omega 生物技術(shù)公司、熒光定量PCR試劑盒UltraSYBR Mixture(Low Roe)購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于天根生化科技有限公司,其它試劑均為常規(guī)試劑。

        1.2 方法

        1.2.1 病原菌接種葉片和果實(shí) 參考張賀等[14]人的方法制備芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)A2的分生孢子懸浮液,使其濃度為4×106個(gè)/mL,用于接種芒果嫩葉和成熟果。

        用清水將貴妃芒的嫩葉、成熟果實(shí)沖洗干凈,然后浸泡在1% NaClO溶液中15 min,再用超純水沖洗3遍后置于保鮮盒中,保持相對(duì)濕度為100%,備用。

        采用束針刺傷嫩葉和成熟果實(shí)表皮,接種20 μL分生孢子懸浮液,28℃下恒溫黑暗培養(yǎng),以接菌0 h的為對(duì)照。用直徑為1 cm的打孔器取10個(gè)接種點(diǎn),按照不同的時(shí)間點(diǎn)取樣后至于液氮速凍、-80℃保存、備用。

        接種葉片后的取樣時(shí)間點(diǎn):0 h、6 h、12 h、24h、36 h、48 h、72 h;接種果實(shí)后的取樣時(shí)間點(diǎn):0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 和 96 h。

        1.2.2 病原菌總RNA的提取和cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄 參照E.Z.N.A.? Fungal RNA Kit中的方法提取不同時(shí)間點(diǎn)的病原菌總RNA,參照Fast Quant RT Kit(with gDNase)試劑盒完成第一鏈cDNA的合成,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍,備用。采用超微量紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳兩者相結(jié)合的方法檢驗(yàn)總RNA的提取效果,確保RNA的提取質(zhì)量滿足實(shí)驗(yàn)需要。

        1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以病原菌PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP211個(gè)致病相關(guān)基因?yàn)閷?duì)象,以ACT作為內(nèi)參基因,所用基因引物序列參考Alkan等[15],由北京華大生物科技有限公司合成,PAGE純化,詳細(xì)引物序列見(jiàn)表1。

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL:ddH2O 8 μL,cDNA 1 μL, 引 物 各 0.5 μL,2×UltraSYBR Mixture 10 μL,檢測(cè)系統(tǒng)為 Quant Studio 6 Flex。

        PCR反應(yīng)程序:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃1 min,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);16℃保存,在72℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

        表1 供試引物序列

        1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算[16],實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System Software)系統(tǒng)導(dǎo)出各樣品的Ct值,以接菌0 h的為對(duì)照,以基因表達(dá)量增加2倍以上為上調(diào),降低50%為下調(diào)。參考Deng等[17]的方法,采用HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖,研究分析各致病相關(guān)基因在不同組織的侵染過(guò)程中的表達(dá)差異情況。

        2 結(jié)果

        2.1 病原菌侵染葉片時(shí)相關(guān)基因表達(dá)量分析

        病原菌侵染嫩葉時(shí),11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量差異明顯,PL、PG在整個(gè)侵染過(guò)程中持續(xù)高效表達(dá)、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量高于0 h的5倍以上,PKS、NRPS、MEP2、HMT、ECH、SDH、LIP和CRAT等8個(gè)基因在接種6 h 后明顯上調(diào)表達(dá),隨后則不同程度地下調(diào)表達(dá),僅CRAT在24 h時(shí)、HMT和LIP在72 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)2倍以上;SIN3P基因則持續(xù)下調(diào)表達(dá)(圖1)。

        圖1 病原菌侵染葉片時(shí)基因差異表達(dá)的熱度圖

        以病原菌侵染葉片時(shí)的不同基因不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量的兩兩差異程度進(jìn)行層級(jí)聚類分析,結(jié)果表明,11個(gè)基因共聚為3個(gè)大的分支,持續(xù)性高效表達(dá)的PG和PL基因聚為1個(gè)分支,表達(dá)量較低的SIN3P、PKS、NROS和ECH4個(gè)基因聚為一個(gè)分支,介于二者之間的其余5個(gè)基因聚為1個(gè)分支,這說(shuō)明表達(dá)量相近的基因會(huì)聚類在同一個(gè)分支上。

        2.2 病原菌侵染果實(shí)時(shí)相關(guān)基因表達(dá)量分析

        病原菌侵染成熟果時(shí),11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量差異明顯,PL、PG、SDH和ECH基因高效表達(dá)、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量高于0 h的3倍以上,其他基因則有不同程度的上調(diào)表達(dá)(圖2)。

        圖2 病原菌侵染果實(shí)時(shí)基因差異表達(dá)的熱度圖

        以病原菌侵染果實(shí)時(shí)的不同基因不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量的兩兩差異程度進(jìn)行層級(jí)聚類,結(jié)果表明,11個(gè)基因共聚為2個(gè)大的分支5個(gè)小的分支,持續(xù)高效表達(dá)的PL、PG、SDH、ECH基因聚為1個(gè)大分支,其中PG和PL聚為1個(gè)小分支,ECH和SDH聚為1個(gè)小的分支,說(shuō)明4個(gè)基因雖持續(xù)上調(diào)表達(dá),但仍有所差異;SIN3P和PKS基因分別單獨(dú)聚為一個(gè)小的分支,SIN3P僅在12 h和48 h是上調(diào)表達(dá),表達(dá)量分別為13.34和2.62倍,96 h為下調(diào)表達(dá),其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量介于1.10-1.89倍之間,PKS在12 h、24 h、48 h和72 h上調(diào)表達(dá),表達(dá)量分別為4.92、15.22、16.35和46.49倍,36 h的為0.68倍,96 h為下調(diào)表達(dá)。

        3 討論

        病原菌在侵染寄主的過(guò)程中,會(huì)調(diào)控自身的致病相關(guān)基因進(jìn)行高效表達(dá),從而調(diào)控分生孢子或菌絲朝著有利于自身侵染的方向生長(zhǎng),實(shí)現(xiàn)病原菌的順利侵染,造成寄主感病。分析致病相關(guān)基因在侵染過(guò)程中的差異表達(dá),可為揭示基因功能提供借鑒,也可為施加藥劑阻礙致病基因的高效表達(dá)、降低病原菌的侵染效率提供參考。Alkan等[15]在研究膠孢炭疽菌侵染番茄果實(shí)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶基因PG和果膠裂解酶基因PL在侵染過(guò)程中持續(xù)高效上調(diào)表達(dá),這與本文研究發(fā)現(xiàn)芒果膠孢炭疽菌侵染葉片和果實(shí)時(shí)PG和PL持續(xù)性地高效上調(diào)表達(dá),具有很好的一致性,這兩個(gè)基因能降解寄主細(xì)胞壁中的果膠,促使其成功地定殖于寄主內(nèi),其單基因突變或雙基因突變均能明顯地降低病原菌的致病力[16]。ECH基因則是先上調(diào)再下調(diào)的表達(dá)方式[17],與本文結(jié)果有差異;PKS基因在膠孢炭疽菌侵染番茄果實(shí)時(shí)為下調(diào)表達(dá),而本實(shí)驗(yàn)中PKS基因的表達(dá)方式為先上調(diào)再下調(diào)表達(dá),與Alkan等[18]的研究結(jié)果有所不同。

        附著胞在膠孢炭疽菌的侵染過(guò)程中起到重要的作用,黑色素的合成積累能增加附著胞的膨壓,從而促進(jìn)病原菌的成功侵染,而小柱孢酮脫水酶SCD基因則是黑色素合成途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶之一[19-20],該基因表達(dá)活性的強(qiáng)弱會(huì)影響到膠孢炭疽菌的侵染效率。本研究發(fā)現(xiàn)小柱孢酮脫水酶(SDH)在病原菌接種葉片6 h時(shí)、接種果實(shí)12 h是上調(diào)表達(dá),而這個(gè)時(shí)期則是病原菌分生孢子侵染的時(shí)期[21],這說(shuō)明小柱孢酮脫水酶SCD參與了分生孢子侵染寄主的過(guò)程中。氰菌胺(Fenxanil)和環(huán)丙酞菌胺(Carpropamid)[22-23]是以小柱孢酮脫水酶為靶標(biāo)的殺菌劑,通過(guò)阻斷脫水步驟而限制黑色素DHN的合成,從而抑制病原菌的侵染,但針對(duì)不同的病原菌,其殺菌效果差異較大,鑒于SDH在膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實(shí)種發(fā)揮重要作用,有必要對(duì)氰菌胺(Fenxanil)和環(huán)丙酞菌胺(Carpropamid)優(yōu)化,而得到殺菌效果更好的殺菌劑,應(yīng)用于芒果炭疽病的防治過(guò)程中。

        4 結(jié)論

        芒果膠孢炭疽菌侵染芒果葉片和果實(shí)過(guò)程中,病原菌的PL、PG、ECH、LIP、PKS、SDH、CRAF、HMT、SIN3P、NRPS和MEP2等11個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)明顯變化。病原菌侵染葉片時(shí),PG和PL基因均持續(xù)高效表達(dá),SIN3P基因表達(dá)較低,其余基因在侵染6 h時(shí)表達(dá)量較高,隨后下降;病原菌侵染果實(shí)時(shí),PL、PG、SDH和ECH等基因高效表達(dá),其余基因則有升有降。

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