顧源 尋子琦 鄭菲 涂濤 姚斌 羅會(huì)穎

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

纖維素是自然界中分布最廣且含量最多的碳水化合物，同時(shí)又是數(shù)量最大的可再生資源。目前，利用可再生生物質(zhì)資源生產(chǎn)替代燃料越來(lái)越受到人們的重視。但是，纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜［1］，纖維素酶對(duì)天然纖維素降解效率比較低，導(dǎo)致工業(yè)化成本很高，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。所以，高的水解效率通常需要對(duì)底物進(jìn)行預(yù)處理，一般包括物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物四種預(yù)處理的方式。物理和化學(xué)方法通常會(huì)造成一定的環(huán)境污染，同時(shí)產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物還會(huì)抑制酶的水解活性［2］。而生物預(yù)處理是一種綠色環(huán)保的方法，通過(guò)對(duì)纖維素晶體結(jié)構(gòu)的疏松和破壞，可以使木質(zhì)纖維素更容易的被纖維素酶水解［3］。研究發(fā)現(xiàn)，一些非水解破壞活性的蛋白能夠促進(jìn)纖維素酶的水解［4］。這些蛋白與纖維素酶存在協(xié)同作用，包括植物膨脹素［5］，來(lái)源于細(xì)菌［6］、真菌和線蟲(chóng)類(lèi)的類(lèi)膨脹素蛋白［7-8］，以及一些輔助蛋白如裂解多糖單加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO）和 Cerato platanin（CP）［9-10］。

膨脹素（expansin）是一類(lèi)擴(kuò)展蛋白，能夠破壞并松散植物的細(xì)胞壁。膨脹素通過(guò)破壞纖維素微纖維間或纖維素和其他細(xì)胞壁多糖間的氫鍵來(lái)發(fā)揮作用，但對(duì)報(bào)道的膨脹素一般對(duì)它們沒(méi)有水解活性［11］，因此可以提高纖維素酶對(duì)纖維素類(lèi)底物的水解［12］。膨脹素的分類(lèi)是基于其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有4種膨脹素家族在植物中已經(jīng)被鑒定［13］，分別是α-膨脹素（EXPA）、β-膨脹素（EXPB）、類(lèi)α-膨脹素（EXLA）、類(lèi)β-膨脹素（EXLB）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，EXPA和EXPB能夠使細(xì)胞壁松弛［14］，類(lèi)似膨脹素的蛋白可能在其他的生物體中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)膨脹素在病原微生物在植物根的定殖［15］及真菌中降解木質(zhì)纖維素等［16］中發(fā)揮作用。非植物的膨脹素蛋白大多屬于類(lèi)膨脹素家族X(qián)（Expansin-like X，EXLX），這些蛋白大多參與細(xì)胞壁的延伸過(guò)程。目前為止，來(lái)源于真菌的里氏木霉（Trichoderma reesei），曲霉屬煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和煙管菌屬煙管菌（Bjerkandera adusta）的TrSwo1，AfSwo1和BaLoosenin，以及細(xì)菌河氏菌屬（Hahella chejuensis）的HcEXLX2，細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的BsEXLX1和線蟲(chóng)球異皮線蟲(chóng)屬金線蟲(chóng)（Globodera rostochiensis）的GrEXPB1都能夠通過(guò)破壞纖維素結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)纖維素酶的活性［7，17-20］。另外，膨脹素參與細(xì)胞壁松弛相關(guān)的其他發(fā)育過(guò)程，如果實(shí)軟化［21］、花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育［22］、種子的發(fā)芽［23］、谷物的生長(zhǎng)（在早期的生長(zhǎng)過(guò)程中，膨脹素主要在谷粒皮中被發(fā)現(xiàn)，隨后在胚乳也能發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明膨脹素可能是取決于谷粒最終重量的原因）［24］等過(guò)程。

傳統(tǒng)膨脹素的結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域D1和D2。D1結(jié)構(gòu)域以極性殘基為主，并且與糖苷水解酶GH45酶有較低的相似性，其對(duì)于細(xì)胞壁的活性是非常重要的。D2結(jié)構(gòu)域是一種非催化模塊，作用類(lèi)似于碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-binding module，CBM），有助于其結(jié)合纖維素。D2結(jié)構(gòu)域具有扁平的芳香族氨基酸殘基，可以與糖環(huán)的疏水中心相互作用［25］。

真菌來(lái)源的swollenin通常包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的信號(hào)肽和一個(gè)典型的真菌類(lèi)型的CBM區(qū)，一個(gè)結(jié)構(gòu)與GH45相似的同源區(qū)以及一個(gè)與膨脹素類(lèi)似的區(qū)域。植物膨脹素通常不大于250個(gè)氨基酸殘基，而真菌中的swollenin是這種尺寸的2倍。該大小的差異進(jìn)一步支持細(xì)菌和真菌膨脹素相關(guān)蛋白的進(jìn)化通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移和獨(dú)立結(jié)構(gòu)域融合事件發(fā)生的假設(shè)［26］。此外，swollenin顯示出與植物擴(kuò)展蛋白不同的獨(dú)特作用模式，但其類(lèi)似于內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的作用，但其不適合任何標(biāo)準(zhǔn)的纖維素酶類(lèi)［27］。

在本研究中，我們從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802中克隆得到了一個(gè)新的類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1，并構(gòu)建了CBM融合基因CBM-Tlexlx1，類(lèi)膨脹素基因及其融合基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并對(duì)其基本性質(zhì)進(jìn)行研究，為在生物工程等高新技術(shù)領(lǐng)域中解決現(xiàn)代纖維素利用率低，難降解等的問(wèn)題上提供了新的思路，以及對(duì)于非植物來(lái)源的類(lèi)膨脹素EXLX家族的基因功能的鑒定提供新的素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802 購(gòu)自日本微生物菌種保藏中心（Japan collection of microorganisms，JCM）；畢赤酵母Pichia pastorisGS115 和質(zhì)粒pPIC9購(gòu)自Thermo Fisher（原Invitrogen）；克隆菌株Escherichia coliTrans-T1和質(zhì)粒pEASY-T3 購(gòu)自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體及固體培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基的配制見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著），MD固體培養(yǎng)基、MM固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基按照Invitrogen公司發(fā)布的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)配方配制。

1.1.3 試劑 真菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；真菌RNA 提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TOYOBO購(gòu)自Tokyo公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)買(mǎi)自New England Biolab公司；FastPfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金公司，蛋白Marker夠買(mǎi)于北京GeneStar生物公司。商品纖維素酶購(gòu)自Sigma公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1的克隆及融合基因CBM-Tlexlx1的構(gòu)建 嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802的全基因組序列已由上海美吉公司完成測(cè)序。經(jīng)過(guò)對(duì)注釋序列進(jìn)行分析，Tlexlx1是一個(gè)典型的類(lèi)膨脹素基因。通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLAST模 塊（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/） 對(duì)該基因的新穎性進(jìn)行評(píng)估，利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù) 測(cè) 其 信號(hào)肽序列。利用Vector NTI Advance 10.0軟件分析Tlexlx1基因序列及編碼蛋白理論蛋白分子量大小、等電點(diǎn)。利用ClustalW軟件和ESPript 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

為了獲得類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1的cDNA序列，將T. leycettanusJCM12802接種于PDB培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d后，以2%接種量轉(zhuǎn)接于以復(fù)合培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d。用干凈濾紙過(guò)濾菌液得到菌體后，置于液氮中用研缽充分研磨，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TOYOBO（Tokyo，Japan）合成cDNA單鏈。并以cDNA為模板，用特異性引物Tlexlx1-F（5′-CGG AATTCGGGCCTCTTGTTGGACGTCAGGA-3′，下劃線為EcoRΙ酶切位點(diǎn)）和Tlexlx1-R（5′-TTGCGGCCGC CTAAAAGTTTGAAGACGCAGTCGTGGT-3′，下劃線為NotI的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后將得到符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物連接至pEASY-T3載體上，并轉(zhuǎn)化Trans-T1菌株，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將同樣來(lái)源的膨脹素基因的CBM區(qū)編碼序列Tlswo-CBM用overlap PCR的方法融合到Tlexlx1的N端，構(gòu)建了融合基因CBM-Tlexlx1。第一輪PCR使用引物CBMF（CGGAATTCCAGAGCAGCTGTGCAGGGACC，下劃線為EcoRΙ酶切位點(diǎn)）和Tlexlx1-CBM-R1（TCCAACAAGAGGCCCCATGGTTCCGGATT TGCACATGGAC）擴(kuò)增得到CBM區(qū)編碼序列，使用引物Tlexlx1-CBM-F1（5′-AAATCCGGAACCATGGGG CCTCTTGTTGGACGTCAG-3′）和Tlexlx1-R擴(kuò)增等到Tlexlx1編碼序列。第二輪PCR將第一輪PCR產(chǎn)物混合后作為模板，使用引物CBMF和Tlexlx1-R擴(kuò)增等到CBM和Tlexlx1的融合編碼基因CBM-Tlexlx1。

1.2.2 畢赤酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1的構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和NotI對(duì)測(cè)序正確的Tlexlx1基因和CBM融合基因CBM-Tlexlx1以及酵母表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切，將正確的目的片段與載體回收，用T4DNA連接酶室溫下連接2 h，轉(zhuǎn)入E. coli TransI-T1感受態(tài)細(xì)胞中，37℃孵育30-60 min，涂于具有氨芐抗性的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落并進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。經(jīng)測(cè)序正確后得到重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1在畢赤酵母中的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1通過(guò)BglII單酶切進(jìn)行線性化，線性化產(chǎn)物通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂至MD平板上，30℃培養(yǎng)2-3 d待菌落長(zhǎng)出。然后，從MD板上挑取96個(gè)單克隆子到帶有1-96編號(hào)MD平板，培養(yǎng)1-2 d。按編號(hào)挑取MD平板上正常生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的15 mL離心管中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，離心去上清，更換為含有0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d，然后離心取上清用于酶活性檢測(cè)。篩選出酶活相對(duì)較高，蛋白量相對(duì)較大的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶的放大培養(yǎng)。酶活高的轉(zhuǎn)化子接入YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d，然后按1%接種量接種于400 mL BMGY培養(yǎng)基30℃、260 r/min搖床中培養(yǎng)2 d，離心去上清，用200 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d（中間補(bǔ)加甲醇一次）。將酶液在12 000 r/min下離心10 min，收集上清液進(jìn)行酶活的測(cè)定及蛋白電泳（SDS-PAGE）分析。

用10 kD的膜包對(duì)上清的粗酶液進(jìn)行濃縮同時(shí)去除小分子等雜質(zhì)并更換緩沖液。濃縮后的酶液用Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）過(guò)夜透析（3 kD透析袋）進(jìn)行脫鹽處理。經(jīng)過(guò)處理后的低鹽濃度的酶液，使用HiTrap Q XL陰離子柱進(jìn)行純化，用1 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰并進(jìn)行酶活力測(cè)定。SDS-PAGE電泳檢測(cè)并分析其純度，純化后的酶液進(jìn)行酶的性質(zhì)分析。并且對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂所測(cè)定。

1.2.4 酶活測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)采取DNS法測(cè)定類(lèi)膨脹素TlEXLX1的活性。底物：大麥葡聚糖、地衣多糖或CMC-Na（900 μL），緩沖液：檸檬酸-磷酸二氫鈉（終濃度為0.1 mol/L），稀釋酶液100 μL，終止劑DNS（1.5 mL，煮沸5 min），OD540下讀取吸光值。

酶活定義：最適反應(yīng)條件下，每分鐘分解底物生成1 μmoL葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

1.2.5 蛋白定量 用蛋白定量試劑盒對(duì)TlEXLX1和CBM-TlEXLX1進(jìn)行蛋白定量。將不同濃度的蛋白標(biāo)品（BSA）和待測(cè)樣品TlEXLX1、CBM-TlEXLX1、加入在酶標(biāo)條中，然后加入200 μL考馬斯亮藍(lán)顯色劑。室溫反應(yīng)8 min后，在波長(zhǎng)（OD595）處讀取吸光值。根據(jù)所測(cè)得的吸光值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.6 類(lèi)膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1基本酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.2.6.1 最適pH的測(cè)定 將純化后TlEXLX1和CBM-TlEXLX1，加入到不同pH（pH 2.2-12.0）100mmol/L的緩沖液（pH 2.2-8：檸檬酸-磷酸氫二鈉；pH 8-9：Tris-HCl；pH10-12：Gly-NaOH）的底物中，在60℃下反應(yīng)10 min，測(cè)定其最適pH。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行及一個(gè)空白對(duì)照，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適pH曲線。

1.2.6.2 最適溫度的測(cè)定 用pH 6.0的緩沖液把酶液稀釋合適的倍數(shù)，在不同溫度（30-70℃）下反應(yīng)10 min測(cè)定其最適溫度，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行及一個(gè)空白對(duì)照，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制最適溫度曲線。

1.2.6.3 類(lèi)膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1比活力及底物特異性的測(cè)定 選取地衣多糖（1%），大麥葡聚糖（1%）、昆布多糖（1%）、CMC-Na（2%）、微晶纖維素（1% Avicel）、葡甘露聚糖（1%）、角豆膠（1%）、木聚糖（1%）和瓜爾豆膠（1%）作為底物，pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度100 mmol/L）緩沖液配置。通過(guò)DNS法測(cè)定TlEXLX1和CBMTlEXLX1的比活力。

比活力單位定義為，每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。（1%為質(zhì)量體積比）。

1.2.7TlEXLX1及 CBM-TlEXLX1與纖維素酶的協(xié)同實(shí)驗(yàn) 采用兩步法進(jìn)行TlEXLX1與纖維素酶的協(xié)同實(shí)驗(yàn)。以10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）作為底物，pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度50mmol/L）緩沖液，體系1 mL。過(guò)程：取TlEXLX1 0 μg、1 μg、5 μg、10 μg、20 μg 和 30 μg 分別用緩沖液稀釋到 100 μL，加入用900 μL 10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）底物中進(jìn)行預(yù)處理，放入金屬?。ń饘僭〉淖饔檬悄軌蚴刮⒕Юw維素反應(yīng)充分）37℃下振蕩24 h（600 r/min），取出樣品90℃下滅活10 min，離心（12 000 r/min），用緩沖液洗3-4遍初去殘留TlEXLX1或CBM-TlEXLX1，分別加入100 μL（0.3 U）的商品纖維素酶，buffer補(bǔ)齊到1 mL，0、30、60和90 min分別取樣120 μL測(cè)定酶活。用DNS法進(jìn)行測(cè)定釋放還原糖的量。

用10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）作為底物，pH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度50 mmol/L）緩沖液，體系1 mL。過(guò)程：加入100 μL的TlEXLX1及 CBM-TlEXLX1（10 μg）對(duì)底物（900 μL）進(jìn)行預(yù)處理，放入金屬浴37℃下振蕩24 h（600 r/min），取出90℃下滅活10 min，離心（12 000 r/min），用緩沖液洗3-4遍去除TlEXLX1和CBM-TlEXLX1。隨后，加入100 μL（0.3 U和0.6 U）的商品纖維素酶，buffer補(bǔ)齊到1 mL，每30 min取樣120 μL測(cè)定酶活。用DNS法進(jìn)行測(cè)定酶活力。

按照上述方法，測(cè)定（1 U，2 U）的商品纖維酶與類(lèi)膨脹素TlEXLX1（10 μg）時(shí)的協(xié)同作用。過(guò)程同上。上述實(shí)驗(yàn)均用金屬浴與完成。

1.2.8 重組酶TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理微晶纖維素的掃描電鏡實(shí)驗(yàn) 用TlEXLX1和CBMTlEXLX1各 300 μg加 入 到 微 晶 纖 維 素（5 mg/mLAvicel）和濾紙（5 mg/mL）的底物中用pH 6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（終濃度50 mmol/L）將體系補(bǔ)齊到1 mL，37℃下輕微震蕩處理24 h，然后烘干被處理過(guò)的底物。分別用Buffer和BSA代替膨脹素作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)前，需對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品上粘上少量的導(dǎo)電膠，用棉簽粘取少量干燥的固體樣品微晶纖維素和濾紙后涂貼在導(dǎo)電膠上，然后去除多余未粘在導(dǎo)電膠上的粉末，進(jìn)行噴金處理30 min后，進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 TlEXLX1基因的克隆及序列分析

T. leycettanusJCM12802類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1基因全長(zhǎng)為1 196 bp，含有1個(gè)內(nèi)含子（83 bp）。cDNA全長(zhǎng)為1 113 bp，編碼370個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子。SignalP預(yù)測(cè)N-端前22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。用NetNGlyc 1.0 Server對(duì)TlEXLX1進(jìn)行N-糖基化預(yù)測(cè)，沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)，融合蛋白CBMTlEXLX1有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。Tlexlx1編碼蛋白TlEXLX1的理論蛋白分子量大小為35.4 kD，等電點(diǎn)為4.3，而CBM-Tlexlx1的理論分子量為51.5 kD，等電點(diǎn)為4.3。

根據(jù)BlastP比對(duì)結(jié)果顯示Tlexlx1編碼蛋白與Penicilliopsis zonataCBS 506.65來(lái)源的假想蛋白hypothetical protein ASPZODRAFT_140583具有最高的序列相似性為81%，與Penicillium digitatumPd1來(lái)源的Expansin-like protein 1序列相似性為56%?；騎lexlx1提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列注冊(cè)號(hào)為 MH036891。

2.2 表達(dá)載體pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1的構(gòu)建與重組蛋白的表達(dá)與純化分析

將不含有自身信號(hào)肽的Tlexlx1和CBM-Tlexlx1c-DNA序列，以正確的閱讀框克隆到質(zhì)粒pPIC9上信號(hào)肽編碼序列α因子后，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建成功。

對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBMTlexlx1轉(zhuǎn)化畢赤酵母的克隆子通過(guò)酶活力測(cè)定及蛋白電泳檢測(cè)進(jìn)行篩選，成功選到了陽(yáng)性克隆子。將陽(yáng)性克隆子通過(guò)搖瓶水平發(fā)酵，獲得發(fā)酵上清液。通過(guò)濃縮和純化得到并收集得到了純化的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)，根據(jù)蛋白電泳結(jié)果（圖1）可知，重組蛋白TlEXLX1（泳道1）表觀分子量為75 kD，比理論分子量大（TlEXLX1理論分子量為35.4 kD）。融合蛋白CBM-TlEXLX1（泳道2）在75 kD和180 kD處均可發(fā)現(xiàn)明顯條帶，均比理論分子量大（融合蛋白CBM-TlEXLX1的理論分子量為 51.5 kD）。

圖1 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1的SDS-PAGE圖

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，重組蛋白測(cè)定結(jié)果能夠與理論蛋白序列匹配，覆蓋上的肽段為：GPSGNSIK和NKDGTSAYWFSMQVVNANEPVASLEVSTDGGST WQSTTRTYYNYFEKQSGFGTDTVDVRITSTSGATIT VK）。

分子量75 kD（180 kD）融合蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果與理論蛋白序列也都能匹配，覆蓋上的肽段分別為：SGTMGPLVGR，GPSGNSIK和 NKDGTSAYWFS MQVVNANEPVASLEVSTDGGSTWQSTTRTYYNYFEK QSGFGTDTVDVRITSTSGATITVKNVSCQSESTTTASS NF（SGTMGPLVGR，GPSGNSIK和NKDGTSAYWFS MQVVNANEPVASLEVSTDGGSTWQSTTRTYYNYFEK QSGFGTDTVDVRITSTSGATITVK）。

在分子量75 kD和180 kD融合蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，野生型N-端的部分序列和CBM（TlSWO1）末端的部分序列連接成一條肽段（SGTMGPLVGR，下劃線部分屬于CBM序列，無(wú)下劃線屬于野生型序列）。質(zhì)譜結(jié)果說(shuō)明，該蛋白是正確表達(dá)的TlEXLX1類(lèi)膨脹素蛋白，同時(shí)也確定融合蛋白構(gòu)建成功。

通過(guò)N-糖基化預(yù)測(cè)，結(jié)果可知重組蛋白沒(méi)有N-糖基化位點(diǎn)，而融合蛋白存在兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。而通過(guò)對(duì)重組蛋白和融合蛋白進(jìn)行O-糖基化預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在氧糖基化位點(diǎn)。所以，推測(cè)蛋白分子量變大很大程度上受到氧糖基化的影響。

2.3 類(lèi)膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.3.1 類(lèi)膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1最適溫度和最適pH 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBMTlEXLX1的最適溫度均為60℃（圖2-A），最適pH均為6.0（圖2-B）。重組酶TlEXLX1在50ü和70℃下均有90%以上的酶活，而突變體CBM-TlEXLX1在在50℃和70℃下都保持著80%以上的酶活。在pH在4.0-7.0條件下，均能保持85%以上的酶活性。

2.3.2 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1協(xié)同實(shí)驗(yàn)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3-A）可以看出，在所選擇TlEXLX1的濃度范圍內(nèi)，協(xié)同效果沒(méi)有明顯差異，10 μg，20 μg的效果相對(duì)較好，在 90 min時(shí)，分別產(chǎn)生了1.26和1.17 mmol/L的還原糖。

圖2 溫度和pH值對(duì)兩種蛋白催化活性的影響

接下來(lái)選擇10 μg的TlEXLX1和CBM-TlEXLX1與 0.3 U，0.6 U的商品纖維素酶協(xié)同。結(jié)果加入0.6 U的纖維素酶比加入0.3 U的協(xié)同效果明顯。在經(jīng)過(guò)TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理后，加入纖維素酶量為0.3 U時(shí)，在150 min時(shí)分別產(chǎn)生2.49 mmol/L和2.46 mmol/L的還原糖，略高于沒(méi)經(jīng)過(guò)膨脹素處理的直接添加0.3 U纖維素酶所產(chǎn)生的2.29 mmol/L的還原糖。而經(jīng)過(guò)TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理后，加入纖維素酶量為0.6 U時(shí)，在60 min時(shí)分別產(chǎn)生3.06 mmol/L和3.03 mmol/L的還原糖，高于對(duì)照直接添加0.6 U纖維素酶產(chǎn)生的2.49 mmol/L的還原糖（圖3-B，C）。

而選擇10 μg的TlEXLX1與 1 U，2 U的商品纖維素酶協(xié)同，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，加入1 U，2 U的商品纖維素酶在1 h內(nèi)幾乎都沒(méi)有產(chǎn)生協(xié)同效果。在60 min時(shí)，1 U纖維素酶產(chǎn)生了7.38 mmol/L還原糖，略低于空白產(chǎn)生的8.18 mmol/L還原糖。在反應(yīng)40 min后，加入2 U的纖維素酶產(chǎn)生7.12 mmol/L幾乎等于空白產(chǎn)生的7.14 mmol/L還原糖（圖3-D，E）。

2.3.3TlEXLX1和CBM -TlEXLX1底物特異性及比活力測(cè)定TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對(duì)地衣多糖有最高的水解活力，比活分別為7.2 U/mg 和17.2U/mg。其次是大麥葡聚糖和昆布多糖，TlEXLX1的比活力為4.4 U/mg、1.6 U/mg，CBM-TlEXLX1對(duì)大麥葡聚糖和昆布多糖的比活力為9.4 U/mg、3.7 U/mg。TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對(duì)CMC-Na、微晶纖維素、葡甘露聚糖等有微弱的活性。突變體相對(duì)于野生型對(duì)以上3種底物的比活分別提高了2.4倍、2.1倍和2.3倍?？梢?jiàn)，CBM區(qū)能有效提高類(lèi)膨脹素對(duì)底物的水解能力。

圖3 TlEXLX1和CBM-TlEXLX1與商品纖維素酶協(xié)同效果

2.4 TlEXLX1和CBM-TlEXLX1掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

從掃描電鏡的結(jié)果可以看到，未經(jīng)處理的微晶纖維素和濾紙表面很光滑并且很致密，結(jié)構(gòu)性很強(qiáng)。經(jīng)過(guò)重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1處理過(guò)的微晶纖維素（圖4-A-D）和濾紙（圖4-E-H），其表面明顯被破壞，變的粗糙，致密的纖維素結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂，有明顯被腐蝕的痕跡。說(shuō)明了TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對(duì)濾紙和微晶纖維素致密的結(jié)構(gòu)造成了一定的破壞作用，從而推測(cè)更有利于與纖維酶的協(xié)同。

3 討論

真菌來(lái)源的類(lèi)膨脹素主要是swollenin，細(xì)菌來(lái)源的有EXLX和swollenin［28］。來(lái)源于不同家族膨脹素蛋白的氨基酸序列有著明顯不同，相似性只有20%-40%［29］。本實(shí)驗(yàn)從嗜熱真菌克隆到的類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1與P. digitatumPd1 來(lái)源的Expansinlike protein 1相似性?xún)H為56%，而與有晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道的膨脹蛋白（PDB編號(hào)4JVC）只有30%的最高序列相似性。到目前為止，關(guān)于來(lái)源于真菌類(lèi)膨脹素EXLX家族基因的相關(guān)報(bào)道還很少見(jiàn)，因此可以作為研究EXLX類(lèi)膨脹素的新穎性材料。通過(guò)多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因具有典型膨脹素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)［13-14］，但是其N(xiāo)端有一段未知區(qū)域，這與大多數(shù)真菌來(lái)源的類(lèi)膨脹素有著明顯不同。Swollenin的N端存在一個(gè)非常保守的CBM 區(qū)，CBM區(qū)通常有利于swollenin蛋白更好的結(jié)合到纖維素底物上［16］，而在Tlexlx1基因中有一段未知結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域而缺少類(lèi)似CBM區(qū)。該段未知區(qū)域的功能我們將在今后的工作中繼續(xù)研究。我們將swollenin的N端 CBM區(qū)與Tlexlx1的N端融合發(fā)現(xiàn)，融合蛋白CBM-TlEXLX1相對(duì)于野生型TlEXLX1對(duì)葡聚糖酶等底物的水解活力提高了2-2.4倍。因此，可以推斷CBM的加入能更好的的結(jié)合底物并充分發(fā)揮水解功能。

在已報(bào)道的4類(lèi)膨脹素EXPA、EXPB、EXLA和 EXLB中，多數(shù)EXPA 和 EXPB家族的成員在體外都具有膨脹素活性，EXLA 和 EXLB雖然具有典型的膨脹素的結(jié)構(gòu)（包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域），其成員還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似膨脹素的活性［30］。本實(shí)驗(yàn)從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802成功克隆到了一個(gè)類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1，成功在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)，純化的重組酶具有水解葡聚糖底物的活力，及微弱的濾紙和微晶纖維素的水解活力。在大多數(shù)報(bào)道的膨脹素文獻(xiàn)中，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)水解活性。例如，來(lái)源于Trichoderma harzianum（ThSwo）［31］，Trichoderma reesei（TrSwo1），Bacillus subtilis（BsEXLX1）［28］以及來(lái)源于白腐真菌裂褶菌屬（ScExlx1）［32］。

類(lèi)膨脹素TlEXLX1和商品纖維素酶混合反應(yīng)表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。通過(guò)兩步法用TlEXLX1對(duì)微晶纖維素先進(jìn)行處理，然后再用纖維素酶處理，發(fā)現(xiàn)能夠提高纖維酶水解作用，也證明存在協(xié)同作用。根據(jù)報(bào)道，兩步法能夠克服酶對(duì)纖維素樣本的競(jìng)爭(zhēng)，并且通過(guò)洗脫被膨脹素處理的底物，能夠得更多利于纖維素酶結(jié)合的位點(diǎn)。類(lèi)膨脹素蛋白能夠與纖維素進(jìn)行可逆的結(jié)合，因此兩步法不僅能夠更有利于酶與底物的結(jié)合，同時(shí)還能釋放更多的結(jié)合位點(diǎn)［33］。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后再用纖維素酶水解比膨脹素和纖維素酶同時(shí)反應(yīng)水解效應(yīng)增強(qiáng)［6］。掃描電鏡的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了類(lèi)膨脹素TlEXLX1對(duì)微晶纖維素和濾紙有一定松散和破壞作用。之前的文獻(xiàn)也報(bào)道了類(lèi)膨脹素swollenin也具有類(lèi)似的作用效果［31］。

報(bào)道稱(chēng)植物膨脹素在異源系統(tǒng)中以活性的形式表達(dá)是非常困難的［24］，本研究通過(guò)異源表達(dá)，獲得了真菌來(lái)源的與植物膨脹素類(lèi)似作用的蛋白。同時(shí)TlEXLX1還具有水解活性，為膨脹素的研究開(kāi)辟了新的途徑，也為 EXLX支架蛋白的分子工程開(kāi)辟了道路，以闡明蛋白活性的結(jié)構(gòu)需求。TlEXLX1還能夠與纖維素酶協(xié)同配合將木質(zhì)纖維素有效轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖，提高其水解效率，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。今后我們將從蛋白結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化、作用機(jī)制等都方面對(duì)其進(jìn)行深入的研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802中成功克隆得到一個(gè)類(lèi)膨脹素基因Tlexlx1，并成功構(gòu)建融合基因CBM-Tlexlx1。TlEXLX1和CBM-TlEXLX1成功在畢赤酵母中表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)測(cè)定。

TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對(duì)地衣多糖有最高的水解活力，比活分別為7.2 U/ mg 和17.2 U/mg，對(duì)CMC-Na和微晶纖維素均有微弱的水解活性，以地衣多糖為底物的最適pH和最適溫度均為6.0和60℃。類(lèi)膨脹素與商品纖維素酶有一定的協(xié)同作用，使用10 μg類(lèi)膨脹素TlEXLX1和0.6 U商品纖維素酶處理微晶纖維素，協(xié)同效果最好。

通過(guò)掃描電鏡觀察，TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對(duì)微晶纖維素和濾紙的表面有破壞作用。綜上，該真菌來(lái)源的類(lèi)膨脹素TlEXLX1（expansin）有很好的新穎性并在協(xié)同降解纖維素上有潛在的應(yīng)用價(jià)值。