蘇茹月 丁萍 商巾杰

（南京師范大學生命科學學院，南京 210023）

線粒體是細胞進行有氧呼吸產生ATP的場所，是細胞的“動力車間”，是一種半自主復制細胞器。粟酒裂殖酵母線粒體基因組能夠編碼25種tRNA、8種 mRNA、2種 rRNA 及 1個 rnpB［1］。線粒體與人類健康有密切的聯(lián)系，線粒體受損會引發(fā)諸如癌癥，糖尿病，Leigh綜合征，帕金森，嬰兒猝死綜合征等一系列疾?。?-4］，大約有30%-40%的線粒體疾病是由于線粒體呼吸鏈酶缺陷［5-7］造成的，因此有關線粒體的研究越來越受到人們的關注。

線粒體復合體 V（ATP 合酶）分為 F1（α3β3γδε）和F0組分。粟酒裂殖酵母數據庫Pombase預測Atp11（SPAC3A12.12）是 F1-ATP酶的伴侶蛋白，參與ATP合酶的組裝。粟酒裂殖酵母中Atp11具有兩個同源蛋白，分別是芽殖酵母中的ATP11和人中的Atp11p。芽殖酵母中ATP11參與F1的組裝蛋白，其中ATP11的缺失在非發(fā)酵型培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長呼吸受損，這是由于線粒體F1組裝缺陷導致的［8］。并且免疫共沉淀和酵母雙雜交實驗證明ATP11與F1中β亞基的結合位點在Gly114和Leu318核苷酸結構域之間［9］。Δatp11突變體中除了ATPase的含量減少，還降低了細胞色素氧化酶和輔酶QH2-細胞色素c還原酶的濃度［10］。在人中Atp11p是管家蛋白，參與F1-ATPase的組裝并結合β亞基位點［11］。研究表明Atp11p保護胰島素B鏈免于在體外聚集，因此充當分子伴侶［12］。ATPAF1是兒童患有哮喘病的易感基因，同時患有阿爾茨海默病的患者樣品中ATP合酶的量相對于正常群體中明顯減少［13］。因此，ATP11與線粒體功能有著密不可分關系。

芽殖酵母中ATP11的功能已經研究的比較透徹，但粟酒裂殖酵母中Atp11的功能還沒有被報道。因此，本研究旨在探究粟酒裂殖酵母中Atp11參與線粒體功能的機制，為進一步研究粟酒裂殖酵母線粒體蛋白的功能提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381；大腸桿菌E.coliTop10；質粒pFA6ahphMX6，pYJ19（圖1）為本實驗室保存。

圖1 pFA6a-hphMX6及pYJ19圖譜

1.1.2 培養(yǎng)基 YES培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，3%葡萄糖，4種微量元素（adenine、histidine、uracil和leucine），固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉；YES+3%甘油或YES+6%甘油：將YES培養(yǎng)基中的葡萄糖替換成甘油；YES+hph（潮霉素）：YES固體培養(yǎng)基添加潮霉素至終濃度為100 mg/mL。

基礎培養(yǎng)基EMM-leucine（100 mL）：potassium hydrogen phthalate 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 0.555 g，NH4Cl 0.5 g，1 000 × vitamin 1 mL，10 000 × mineral stock 0.01 mL，50 × salt stock 2 mL，Agar Powder 2 g，glucose 2 g；3種微量元素：adenine、histidine和uracil各22.5 mg。其中glucose分開滅菌以防止碳化。

1.1.3 主要試劑 PrimeSTAR高保真聚合酶等PCR反應試劑、限制性內切酶、連接酶均購自TaKaRa公司；PCR引物由上海英駿生物有限公司合成；DNA Marker購自南京百思凱；DNA純化試劑盒以及割膠回收試劑盒購自博巧生物科技公司；SDS、HEPES、Sorbitol、Tris、30%丙烯酰胺購自上海生工。

1.1.4 主要儀器 PCR儀；臺式高速離心機；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)；電泳槽。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 利用DNAMAN軟件設計引物，見表1。

1.2.2 生物信息學分析 粟酒裂殖酵母atp11基因序列來源于酵母基因組數據庫（S.pombe_GeneDB，http://www.pombase.org/）；粟酒裂殖酵母 Atp11及其人的同源蛋白Atp11p的序列來源于NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；芽殖酵母中同源蛋白ATP11的序列來源于SGD數據庫（http://www.yeastgenome.org/）；利用NCBI Protein BLAST進行蛋白序列同源性比對分析；用MitoProt II（http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）分析線粒體信號肽。

表1 本實驗所用引物

1.2.3 載體構建及鑒定atp11-del-hphMX6重組質粒的構建：以野生型菌株yHL6381基因組為模板，以Atp11-up及Atp11-down為引物分別擴增得到atp11的基因5′端上游同源臂（528 bp）和3′端下游同源臂（533 bp），分別將其構建在載體pFA6a-hphMX6（圖1-A）的SalI/SmaI和SacI/SpeI位點，并進行雙酶切驗證。

Atp11-GFP重組質粒的構建：以野生型菌株yHL6381基因組為模板和pYJ19-GFP為引物通過PCR擴增得到atp11基因目的片段，將其構建到載體pYJ19（圖1-B）的PstI/SalI位點上，從而實現(xiàn)在C端添加GFP標簽，并進一步進行酶切驗證。

1.2.4 酵母醋酸鋰轉化［14］及菌株鑒定 以atp11-del-hphMX6重組質粒為模板，Atp11-up的正向引物和Atp11-down的反向引物為引物，擴增目的片段，通過醋酸鋰轉化導入yHL6381菌株中，并在YES+hph（潮霉素）抗性平板上篩選；重組質粒Atp11-GFP經NruI線性化，獲得目的片段，醋酸鋰轉化導入yHL6381菌株中，涂布于EMM-leucine平板上；目的片段通過同源重組的方法整合在酵母基因組上。菌株鑒定：以yHL6381基因組和挑取的醋酸鋰轉化子基因組為模板，再以Atp11-yz為引物進行PCR驗證；Atp11-GFP菌株通過熒光顯微鏡觀察進行驗證。

1.2.5 Δatp11突變體表型研究 挑取yHL6381菌株和Δatp11突變體于YES液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數期，將細胞依次按10倍梯度稀釋，分別點至YES，YES+3%甘油，YES+6%甘油平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，拍照。

1.2.6 GFP熒光定位實驗 接種Atp11-GFP菌株于EMM-leucine液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收菌。用1×PBS洗滌兩次之后，在30℃與10 μmol/L MitoTracker染料孵育1-2 min；制片，觀察。

1.2.7 Western blotting 提取yHL6381和Δatp11菌株的線粒體［15］，通過SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳分離蛋白質，轉膜。用抗體檢測：一抗：anti-Cob1（1/1 000），anti-Cox1（1/2 000），anti-Cox2（1/300），anti-Cox3（1/300），anti-Atp6（1/2 000），anti-Hsp60（1/2 000，作為內參）。二抗：IRDye800CW羊抗兔抗體。Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測結果。

2 結果

2.1 重組質粒驗證與菌株鑒定

以野生型基因組yHL6381為模板擴增atp11基因的上游同源臂和下游同源臂大小分別為528 bp和533 bp（圖2-A）；重組質粒atp11-del-hphMX6和Atp11-GFP構建成功（圖2-B-D）。

同源重組的結果為在裂殖酵母基因組上抗性篩選標記hph潮霉素基因（1651 bp）替代了atp11（861 bp）基因，PCR驗證結果（圖3-A）顯示Δatp11突變體構建成功。另外，Atp11-GFP菌株在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，說明Atp11-GFP菌株構建成功（圖3-B）。

圖2 重組質粒的構建及酶切驗證

圖3 敲除菌Δatp11和Atp11-GFP的驗證

2.2 Δatp11突變體在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上表現(xiàn)生長受損

為了研究Atp11的生物學功能，通過構建Δatp11突變體，在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基中來培養(yǎng)yHL6381和Δatp11菌株。結果（圖4）表明，一方面，在以葡萄糖為碳源的YES培養(yǎng)基上，yHL6381和Δatp11突變體生長狀態(tài)一致，此時，它們可以利用葡萄糖進行無氧呼吸，不依賴于線粒體。另一方面，在以甘油為碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基上，相比于野生型菌株，Δatp11敲除菌的生長受到嚴重的抑制。這是由于在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上，細胞只能進行有氧呼吸，依賴于線粒體產生ATP。因此Atp11對于線粒體功能是必不可少的。

2.3 熒光顯微鏡觀察結果表明Atp11定位于線粒體

atp11基因缺失之后影響了線粒體功能，暗示Atp11蛋白很有可能進入線粒體行駛功能。生物信息學分析結果顯示，Atp11的N端有一段由31個氨基酸殘基組成的線粒體定位序列（MLPIWKLPVNHLLCHSFKSIPRT），可信度高達90.61%。

圖4 Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

利用線粒體染料來確定Atp11的定位，線粒體marker MitoTracker Red 是一種用于染活細胞線粒體的染料，在熒光顯微鏡Red通道下發(fā)出紅色熒光。Atp11-GFP能夠表達綠色熒光蛋白，在GFP通道下發(fā)綠色熒光。如圖5 所示，同一視野中綠色熒光和紅色熒光重疊后發(fā)出橙色熒光，這就證實Atp11確實定位在線粒體，結合前期表型實驗，再次證實Atp11蛋白與線粒體功能密切相關。

圖5 Atp11-GFP的熒光顯微鏡觀察

2.4 Atp11對線粒體基因組編碼蛋白穩(wěn)態(tài)水平有影響

通過Western blotting技術檢測atp11缺失之后對線粒體基因組編碼的蛋白穩(wěn)態(tài)期水平的影響。結果（圖6）顯示Δatp11突變體中，Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白水平相對于野生型菌株顯著降低，Δatp11突變體中幾乎沒有mt-DNA編碼蛋白質的殘留。Cox1、Cox2和Cox3參與組成呼吸鏈復合體IV，Atp6參與組成復合體V。線粒體呼吸鏈復合體組裝受損，導致Δatp11突變體不能在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上正常的進行氧化磷酸化，從而表現(xiàn)出呼吸缺陷的生長狀態(tài)。因此，Atp11對線粒體呼吸鏈復合體亞基的組裝是必需的，對線粒體呼吸鏈功能的發(fā)揮起重要作用。

圖6 Western blotting檢測Δatp11菌中線粒體基因組編碼的蛋白質表達量

3 討論

線粒體呼吸鏈包含多種線粒體呼吸鏈酶，如NADH脫氫酶、琥珀酸氧化還原酶、細胞色素c還原酶、細胞色素c氧化酶和ATP合成酶。Cob1由細胞色素c還原酶編碼，Cox1、Cox2和Cox3由細胞色素c氧化酶編碼，而Atp6則由ATP合成酶編碼。線粒體呼吸鏈酶經過一系列的氧化還原過程最終形成ATP，為肌體提供能量。如果線粒體呼吸鏈酶合成受損，將會引起線粒體功能缺陷，從而引發(fā)線粒體相關疾病。

已知芽殖酵母中敲除ATP11會在非發(fā)酵型培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長呼吸受損現(xiàn)象。通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)芽殖酵母中的ATP11蛋白與裂殖酵母中的Atp11同源性約為38%。因此，本研究在粟酒裂殖酵母中構建Δatp11菌株，發(fā)現(xiàn)Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)中表現(xiàn)出呼吸鏈受損生長；進一步研究得出Atp11定位于線粒體中，從而推測Atp11可能與線粒體基因組編碼蛋白有關。通過Western blotting實驗證明了Atp11會影響Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白穩(wěn)態(tài)水平。雖然在Δatp11菌中蛋白的穩(wěn)態(tài)水平顯著降低了，但Atp11是影響這些蛋白的轉錄、合成還是蛋白的穩(wěn)定，有待進一步研究。

另外，芽殖酵母ATP11主要序列分為4個結構域：括線粒體前導序列（殘基1-39），N端結構域（NTD，殘基40-111），功能結構域（殘基 112-183）和C末端結構域（殘基184-318）。Atp11功能結構域位于苯丙氨酸-120和天冬氨酸-174序列之間，并且這段功能結構域對是維持線粒體內蛋白質的穩(wěn)定性是非常重要的［16］。而裂殖酵母中的Atp11p含有一個ATP超家族結構域，這個結構域是否對線粒體中蛋白質的穩(wěn)定性起作用目前還不清楚。接下來可以通過設計相關的實驗來研究Atp11p在線粒體中發(fā)揮的作用。

4 結論

粟酒裂殖酵母atp11基因大小為861 bp，共編碼286氨基酸殘基。本文主要研究芽殖酵母ATP11的同源蛋白Atp11。敲除atp11構建突變體菌株，發(fā)現(xiàn)Δatp11在非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出呼吸缺陷型生長，說明Δatp11菌是線粒體功能缺陷菌。通過熒光定位實驗結果得出Atp11定位于線粒體中，這進一步說明Atp11是在線粒體中發(fā)揮作用。最后，Western blotting實驗證明了Atp11的缺失會導致復合體III的Cob1、復合體IV的部分亞基Cox1，Cox2，Cox3、復合物V中的Atp6的蛋白表達水平顯著降低。復合體亞基組裝受阻導致線粒體呼吸功能受損而引發(fā)在甘油培養(yǎng)基上不能正常生長。