王健 林少汾 董紅 陳純(通訊作者)

（1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科 廣東 廣州 510120）

（2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院兒科 廣東 深圳 518107）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）是兒童時期發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是由造血干細(xì)胞增殖分化異常而引起的惡性血液病。目前在幾乎所有的國內(nèi)外兒童ALL化療方案中，左旋門冬酰胺酶（L-asp）和糖皮質(zhì)激素是誘導(dǎo)緩解方案中首選的有效治療藥物。但是，L-asp與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合誘導(dǎo)化療的同時也會妨礙胰島素的產(chǎn)生、釋放及功能，這兩種藥物均易誘發(fā)高血糖，發(fā)生率為4%～20%。并發(fā)高血糖導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良，除外高血糖增加感染的幾率外，高血糖本身合并的高胰島素及高胰島素生長因子Ⅰ型受體（IGF-ⅠR）水平或使用胰島素控制高血糖導(dǎo)致的高胰島素水平，也可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因之一。本課題通過體外實驗探討抗IGF-ⅠR單克隆抗體（anti-IGF-ⅠR monoclonal antibodies mAbs)對ALL細(xì)胞株Jurkat及Reh細(xì)胞周期的影響，間接證實IGF-ⅠR介導(dǎo)的AKT/mTOR通路在細(xì)胞凋亡中的可能作用。

1.材料和方法

1.1 一般資料

研究靶細(xì)胞為：Jurkat（人T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞）、Reh（人急性非B非T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞），細(xì)胞株購自上?？茖W(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。將Jurkat及Reh細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天進(jìn)行半量傳代。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)期生長的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板.每孔加入lml細(xì)胞液，加入終濃度為0和lμg/ml的抗IGF-ⅠR單克隆抗體（ab16890），培養(yǎng)48h，收集對照組和處理組細(xì)胞，PBS洗滌2次，70%乙醇2ml 4℃固定24h。離心棄上清，PBS洗滌2遍后加人300μ1碘化丙啶(PI)染液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育后上機(jī)檢測，所有試驗重復(fù)3次。

2.結(jié)果

以1μg/ml的ab16890作用于ALL細(xì)胞株后上機(jī)檢測細(xì)胞周期，在Jurkat細(xì)胞中（表1、圖1），與對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞明顯增多（P=0.025），S期細(xì)胞減少（P=0.047），而G2/M期細(xì)胞變化不大（P=0.478），說明加藥后使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

Table.1 The percentage of each phase in theJurkat cells cycle that compared between two groups

Figure.1 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Jurkat cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.Comparison of study variables between two groups were analyzed by paired T test.

在Reh細(xì)胞中（表2、圖2），在加入1μg/ml的ab16890及胰島素作用后，與對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞明顯增多（P=0.020），S期細(xì)胞減少（P=0.031），而G2/M期細(xì)胞也減少（P=0.045），變化趨勢與Jurkat細(xì)胞基本一致。

Table.2 The percentage of each phase in theReh cells cycle that compared between two groups.

Figure.2 The distribution of each phase of study variables between two groups were in Reh cell cycle compared betweentwo analyzed by paired T test.groups were showed using histogram.

3.討論

目前已有體外實驗證實，胰島素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，主要是通過活化AKT/mTOR信號通路途徑。PI3K/AKT/mTOR是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，通過活化多種下游的效應(yīng)分子，介導(dǎo)重要的細(xì)胞生理功能，包括促進(jìn)細(xì)胞的增殖、活力和抑制凋亡、自吞噬，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。而IGF-Ⅰ是PI3K/AKT信號通路的上游調(diào)節(jié)因子，發(fā)生高血糖時機(jī)體胰島素分泌，體內(nèi)的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ產(chǎn)生增加，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ通過與IGF-1R結(jié)合募集PI3K到細(xì)胞膜并使其被激活，從而活化AKT/mTOR信號通路，產(chǎn)生下游生物學(xué)效應(yīng)。近十年以來，以IGF-ⅠR為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療逐漸成為腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[2]。目前，體外實驗及臨床腫瘤活體樣本研究均發(fā)現(xiàn)，腫瘤的進(jìn)展多與IGF-ⅠR表達(dá)量的增多有關(guān)[3]，且IGF-ⅠR的高表達(dá)往往伴隨著較差的預(yù)后。因此，阻斷IGF-ⅠR的活化當(dāng)前已盡可能的應(yīng)用于各種腫瘤治療中。抗IGF-ⅠR單克隆抗體作為一種靶向結(jié)合蛋白，可與IGF-ⅠR特異性結(jié)合，抑制IGF-ⅠR與其配體的結(jié)合，從而阻斷其介導(dǎo)的通路信號并較弱下游生物學(xué)效應(yīng)。本實驗采用abcom公司生產(chǎn)的抗IGF-ⅠR單克隆抗體ab16890，以ALL細(xì)胞株為研究對象，探討抗IGF-ⅠR單克隆抗體對細(xì)胞周期的影響和可能機(jī)制。對于阻斷AKT/mTOR信號通路對細(xì)胞周期的影響，有研究發(fā)現(xiàn)PI3K的過度活化是細(xì)胞發(fā)生癌變的必要因素。PI3K能夠激活細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶,使細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，誘導(dǎo)DNA的合成，同時PI3K也能對細(xì)胞周期依賴蛋白抑制物p27的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。Collado等[4]應(yīng)用PI3K的抑制劑LY294002作用于人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p27表達(dá)升高,細(xì)胞阻滯在G0/G1期。另有文獻(xiàn)報道[5]，采用抗IGF-ⅠR單克隆抗體MK-0646作用于子宮內(nèi)膜癌兩種細(xì)胞株ECC-1及USPC-1后檢測細(xì)胞周期，與IGF-Ⅰ處理細(xì)胞后相比，兩種細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均增加，同時S+G2/M期細(xì)胞減少。本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)檢測在胰島素的基礎(chǔ)上加用1μg/mlab16890培養(yǎng)后細(xì)胞周期的變化，與陰性對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞明顯增多（P=0.025、0.020），S期細(xì)胞減少（P=0.047、0.031），而G2/M期細(xì)胞變化不大（P=0.478、0.045），說明加藥后使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，與上述文獻(xiàn)報道一致，猜測ab16890誘導(dǎo)ALL細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞阻滯在G0/G1期可能與胰島素介導(dǎo)的AKT/mTOR信號通路受到阻滯有關(guān)。