馮旭，許恩師

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001)

隨著社會的不斷發(fā)展，目前缺血性腦血管病已經(jīng)成為危害人類健康最常見的一種疾病，其主要的病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成，目前大量的臨床實驗及研究證實，AS在血管壁形成的主要原因為，富含脂類的泡沫不斷聚集而產(chǎn)生[1]。其中巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成原因是由于氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在細(xì)胞內(nèi)的不斷蓄積而產(chǎn)生[2]。

近年來，為了研究新型改善血脂類藥物，人們將關(guān)注點集中在血漿脂蛋白代謝過程中的兩個關(guān)鍵步驟中： 其一為ox-LDL參與的泡沫細(xì)胞的形成，其二為與高密度脂蛋白代謝密切相關(guān)的細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)的相關(guān)信號靶點。

丹酚酸B屬于酚酸類化合物，作為丹參的重要藥理學(xué)活性水溶性組成成分，被廣泛認(rèn)為具有抗氧化活性，包含預(yù)防LDL氧化作用以及對脂質(zhì)過氧化的作用[3]。ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1 )目前已知的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出到成熟高密度脂蛋白粒子上，同時與其他轉(zhuǎn)運(yùn)載體相互作用，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCG1的重要功能除了能移除體內(nèi)過多含量的膽固醇，并且可以參與炎癥抑制，因此ABCG1作為重要的靶點，用于抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的研究過程[4]。

現(xiàn)有的臨床研究中，未發(fā)現(xiàn)丹酚酸B對巨噬細(xì)胞中ABCG1 mRNA表達(dá)的相關(guān)報道，此次實驗擬通過觀察丹酚酸B對人單核源性巨噬細(xì)胞泡沫化的影響，通過RT-PCR 檢測ABCG1 mRNA的表達(dá)，從而將ABCG1這一重要靶點引入泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的研究中。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器

THP-1單核巨噬細(xì)胞株，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京協(xié)生細(xì)胞生物學(xué)研究所)，佛波酯(PMA)，RPMI-1640培養(yǎng)基，油紅0(Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液(上海山進(jìn)生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時熒光定量RT-PCR試劑盒(瑞士Roche公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海杰涵實驗設(shè)備有限公司)，實時定量PCR 儀(ABI 公司)，丹酚酸B(中國藥品生物制品檢定所，純度為97.2%)，其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗中泡沫細(xì)胞的培養(yǎng)及實驗方法分組

首先將THP-1細(xì)胞放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞的生活環(huán)境為10%的小牛血清、其中加入1×108U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。在每次實驗開始前，首先分化THP-1細(xì)胞，方法為采用150 nmol/L佛波酯加入細(xì)胞培養(yǎng)基中24 h，此過程可以使THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，之后加入ox-LDL，將濃度調(diào)整為100 mg/L時，泡沫細(xì)胞形態(tài)及活性良好。將實驗細(xì)胞在每次實驗開始時分別加在6孔培養(yǎng)板中，每孔的密度平均分配。先以100 μmol/L 丹酚酸B加入實驗細(xì)胞中,分別在8、16、24 h收集細(xì)胞，提取每個實驗組中的mRNA，根據(jù)檢測結(jié)果選擇16 h處理時間；再分別以不同濃度丹酚酸B加入巨噬細(xì)胞中，進(jìn)行實驗檢測數(shù)據(jù)。每組設(shè)置5個重復(fù)，每次試驗獨立重復(fù)5次。

1.2.2 油紅O對于泡沫細(xì)胞的染色和實驗組脂質(zhì)染色的半定量分析

細(xì)胞經(jīng)上述方法處理后，用PBS將泡沫細(xì)胞反復(fù)沖冼，將其放置在4 ℃的環(huán)境中，加入10%的甲醛，放置10 min，固定細(xì)胞，用油紅O方法進(jìn)行細(xì)胞染色：水冼 5 min,放置在60%的異丙醇中5 min,放置在新鮮過濾的油紅O中染色10 min 60%異丙醇分5 min，水冼5 min,采用明礬染液染色細(xì)胞5 min，分色及反藍(lán)巨噬泡沫，水洗細(xì)胞5 min，然后進(jìn)行照相比對。Wada方法[5]進(jìn)行半定量分析細(xì)胞內(nèi)脂類含量。如果被染色劑染成紅色的細(xì)胞脂類成分面積小于細(xì)胞核的面積，可以將該類細(xì)胞標(biāo)記為陰性細(xì)胞,相反，被染色劑染成紅色的脂類成分面積等于或大于細(xì)胞核的面積則可以將這類細(xì)胞標(biāo)記為陽性細(xì)胞。每個實驗組孔隨機(jī)計數(shù)一個視野(×400)的細(xì)胞。

1.2.3 高效液相色譜法分析細(xì)胞內(nèi)脂類含量

參照peat J的實驗方法，對于實驗細(xì)胞組分的膽固醇含量進(jìn)行高效液相色譜測定[6]，膽固醇數(shù)量值用外標(biāo)法峰面積進(jìn)行定性定量測定。C18為色譜柱，流動相：異丙醇∶正庚烷∶乙腈的比值設(shè)定為35∶12∶52，單位為v/v，采用非梯度洗脫；實驗流速為1 mL/min；檢測波長設(shè)定為210 nm，檢測到第8分鐘；柱溫設(shè)定為20 ℃。使用已知的CE酶水解CE得到總膽固醇(TC)量,以TC-FC量代表膽固醇酯(CE)的量。

1.2.4 熒光實時定量(RT-PCR)

將實驗組及對照組細(xì)胞處理完畢，按照說明書的方法提取RNA，使用電泳方法檢測RNA的完整性，使用核酸蛋白檢測儀檢測測定RNA 溶液的濃度和純度。公司預(yù)先設(shè)定好引物基因，使用兩步法擴(kuò)增mRNA，按公司提供的引物序列進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增采用20 μL體系，每個樣品設(shè)5 個重復(fù)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞泡沫化模型的建立

將ox-LDL加入THP-1單核巨噬細(xì)胞24 min后,應(yīng)用油紅O染色半定量分析結(jié)果顯示：正常對照組中，細(xì)胞中脂類無紅染現(xiàn)象，在ox-LDL誘導(dǎo)組中,經(jīng)油紅O染色后，陽性細(xì)胞滿布于視野中。使用半定量方法測定經(jīng)過油紅O處理的陽性細(xì)胞數(shù)量可以看出(表1)，陽性細(xì)胞比率由(8.35±1.20)%增加到(83.7±0.78)%，比例提高約10倍，說明此種方法處理的巨噬細(xì)胞泡沫化效果明顯。

表1 不同濃度丹酚酸B處理16 h后油紅O染色陽性細(xì)胞的相對含量

注：與對照組相比：#P<0.01；與ox-LDL組相比：■P<0.01

2.2 丹酚酸B處理泡沫細(xì)胞后，CE/TC值的量-效關(guān)系

應(yīng)用不同濃度丹酚酸B處理泡沫細(xì)胞后，油紅O染色陽性細(xì)胞的數(shù)量比例明顯減少，當(dāng)濃度在100 μmol/L時，陽性細(xì)胞比例接近正常細(xì)胞(表1)。HPLC檢測結(jié)果顯示，CE/TC值隨著丹酚酸B濃度的增加而降低(表2，■P<0.01)，說明丹酚酸B處理泡沫細(xì)胞后減少膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)聚集，有效抑制THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化。

表2 不同濃度丹酚酸B處理16 h后細(xì)胞中

注：與對照組相比：#P<0.01；與ox-LDL組相比：■P<0.01

2.3 丹酚酸B對ABCG1 mRNA 表達(dá)的影響

前期實驗確定16 h為ABCG1 mRNA 表達(dá)的最佳時間，將此時間設(shè)定為處理時間。選擇不同濃度的丹酚酸B(詳見實驗組)干預(yù)泡沫化的THP-1 細(xì)胞16 h，可見ABCG1 mRNA 表達(dá)水平隨丹酚酸B濃度增加而升高，其中100 μmol/L 丹酚酸B處理組為0 μmol/L 丹酚酸B的2.12倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

目前對于AS形成的研究中，有兩種理論最為盛行。其中之一“損傷反應(yīng)”理論認(rèn)為，AS的形成過程中最開使發(fā)生的為血管內(nèi)皮的損傷，內(nèi)皮損傷后，單核細(xì)胞以及以LDL為主的循環(huán)脂蛋白順著破損的內(nèi)膜間隙開始遷移，這些作用導(dǎo)致單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞不斷攝入修飾的LDL，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的泡沫化[7 -8]。另一種“滯留反應(yīng)”理論認(rèn)為，LDL首先遷移到內(nèi)膜間隙，通過與蛋白多糖結(jié)合形成大分子，滯留在內(nèi)膜間隙中并被修飾，接著被巨噬細(xì)胞攝取，進(jìn)而引起巨噬細(xì)胞的泡沫化[9]。本實驗在體外模擬泡沫細(xì)胞的形成過程，用ox-LDL處理巨噬細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)瓶2濃度調(diào)整100 mg/L時，巨噬細(xì)胞泡沫化最為高效，泡沫化率接近95%。

ABCG1 為跨膜蛋白，是ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的重要一員，ABCG1消耗ATP完成介導(dǎo)蛋白質(zhì)、膽固醇、磷脂等多種物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究表明，ABCG1主要作用為使膽固醇流出到成熟的高密度脂蛋白粒子上，促進(jìn)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)。在巨噬細(xì)胞中，ABCG1的表達(dá)可以防止脂質(zhì)的過量累積，從而具有防止動脈粥樣硬化的作用[10]。目前有關(guān)報道提出，巨噬細(xì)胞中的ABCG1通過多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，還可以加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)高密度脂蛋白的表達(dá)，對于細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)及趨化作用起到積極的抑制作用，從而達(dá)到防止動脈粥樣硬化的作用[11]。ABCG1 在細(xì)胞內(nèi)的多種作用可以將炎癥反應(yīng)和脂類物質(zhì)的代聯(lián)系在一起。本研究顯示，100 μmol/L 丹酚酸B處理THP-1 細(xì)胞16 h 顯著增加了ABCG1 mRNA 的表達(dá)，使得丹酚酸B在 抑制AS 和炎癥相關(guān)疾病的機(jī)制得以補(bǔ)充。

丹酚酸B作為重要的酚酸類化合物，為丹參的主要藥理學(xué)活性組成成分，并具有良好的水溶性[12]。目前注射用丹參多酚酸鹽已在臨床上被廣泛應(yīng)用，尤其在治療缺血性腦血管疾病的治療中尤為重要，丹酚酸B鎂鹽在其中扮演重要角色[13]。本實驗首先建立泡沫巨噬細(xì)胞模型，然后使用不同濃度的丹酚酸B對實驗組泡沫細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。實驗結(jié)果顯示，丹酚酸B處理泡沫細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)紅染細(xì)胞成分及細(xì)胞內(nèi)CE/TC值隨著丹酚酸B濃度的增加而降低(P<0.01)，說明丹酚酸B可有效抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，促進(jìn)膽固醇向細(xì)胞外流出。100 μmol/L 丹酚酸B處理泡沫細(xì)胞16 h后，顯著增加了ABCG1 mRNA 的表達(dá)，提示這可能為丹酚酸B抗AS的一個新的作用機(jī)制，進(jìn)一步豐富了丹酚酸B在抗動脈粥樣硬化過程中的作用。綜上所述，丹酚酸B的抗動脈粥樣硬化作用除已知的調(diào)脂作用外，與其通過上調(diào)ABCG1表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞攝取膽固醇，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化有關(guān)。本研究的后續(xù)工作將從分子水平對丹酚酸B抗動脈粥樣硬化和抑制細(xì)胞泡沫化的機(jī)制進(jìn)行深入探討。