司 敏，陳鏡宇，馬 旸，常 艷，魏 偉

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)的滑膜炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。T細(xì)胞與RA的發(fā)生密切相關(guān)，大量的研究[2-5]表明活化的T細(xì)胞是RA免疫紊亂和關(guān)節(jié)損傷的主要誘導(dǎo)因子。大量過度激活的T細(xì)胞浸潤關(guān)節(jié)滑膜，與滑膜細(xì)胞、免疫細(xì)胞相互活化，引起關(guān)節(jié)滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞。人參皂苷CK為人參皂苷在人腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，是人參皂苷在體內(nèi)吸收和發(fā)揮活性作用的主要形式[6]。前期研究[7-9]顯示CK對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠和膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠T細(xì)胞異常的活化有抑制作用，CK可以下調(diào)共刺激分子CD28和T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，上調(diào)共抑制分子細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡受體1 (programmed cell death protein1，PD-1)，上調(diào)初始T細(xì)胞數(shù)量；減少T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)和IL-2的分泌，下調(diào)活化T細(xì)胞數(shù)量；抑制活化的T細(xì)胞增殖與效應(yīng)T細(xì)胞分化，同時上調(diào)Treg的數(shù)量；CK可以減少T細(xì)胞活化的共刺激信號，抑制T細(xì)胞的活化。但是這種抑制作用的作用機(jī)制和作用靶點仍不清楚。有文獻(xiàn)[10]報道CK具有與甾體類激素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，CK可與地塞米松競爭性結(jié)合激動糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)，CK對免疫細(xì)胞的作用是否與活化GR有關(guān)仍不清楚。該研究采用GR拮抗劑，對CK抑制AA大鼠T細(xì)胞過度活化的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體質(zhì)量(150±20) g，購自安徽省實驗動物中心，許可證編號：SCXK(皖)2011-002。實驗中涉及的動物實驗方案均經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2藥物和試劑 人參皂苷CK(分子量622.18，批號：S141001)購自浙江海正藥業(yè)有限公司；糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(RU486)、地塞米松(Dexamethasone)購自美國Sigma公司；DMEM、1640培養(yǎng)基購自美國BI公司；抗CD25、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ流式抗體(美國BD公司)；IL-4、GM-CSF(美國Peprotech公司)；CCK8試劑盒(日本同仁公司)。

1.1.3主要實驗儀器 IX-40倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Tecan Infinite M1000 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司)；KDC-40超速離心機(jī)(科大創(chuàng)新中佳公司)；2306-2型CO2培養(yǎng)箱(美國SHEL LAB公司)；GL20A全自動高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Advantage公司)。

1.2實驗方法

1.2.1制備AA大鼠模型 將10 mg/ml完全弗氏佐劑(Freund's complete adjuvant,CFA)充分混勻，于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA 0.1 ml致炎，得AA大鼠模型。正常組同法注射生理鹽水。

1.2.2T細(xì)胞增殖檢測 無菌取大鼠胸腺，常規(guī)方法制備正常和AA大鼠T淋巴細(xì)胞懸液(1×107/ml)，分別將細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔加入50 μl細(xì)胞懸液，AA大鼠的T淋巴細(xì)胞用不同濃度的CK(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)以及糖皮質(zhì)激素受體(GR)拮抗劑(RU486 10 μmol/L)預(yù)處理后加ConA(終濃度5 mg/L)，終體積為100 μl，設(shè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。終止培養(yǎng)前3 h，每孔加入10 μl CCK，酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度值。

1.2.3T細(xì)胞的純化 正常大鼠和AA大鼠處死后，剪下大鼠的脾臟，進(jìn)行破碎處理并使用 70 μm的尼龍網(wǎng)獲得脾臟的單細(xì)胞懸液，室溫靜置2 min以除去其中的血紅細(xì)胞。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗2遍并離心(1 500 r/min，8 min)。棄去上清液并重懸于10%胎牛血清(FBS)RPMI-1640中以調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×108/ml。細(xì)胞通過尼龍柱分選T淋巴細(xì)胞。將超凈臺內(nèi)垂直固定的尼龍柱下端連接變速開關(guān)，加20 ml預(yù)熱的無血清RPMI-1640平衡，之后加預(yù)熱的15 ml含5%FBS的RPMI-1640平衡。關(guān)閉開關(guān)，加入2 ml以上制備好的細(xì)胞懸液，慢慢打開開關(guān)，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍柱，關(guān)閉開關(guān)，加入1 ml含5%FBS的RPMI-1640，蓋上無菌容器，37 ℃孵育60 min。溫育結(jié)束后，打開開關(guān)，加入20 ml預(yù)熱的5%FBS的RPMI-1640,通過重力作用洗脫柱中的細(xì)胞，收集流出的細(xì)胞即為T細(xì)胞(回收率約為20%)。用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液(1×106細(xì)胞/ml)，備用。

1.2.4成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的培養(yǎng) AA大鼠處死，在0.1%苯扎溴銨溶液中浸泡5 min滅菌。在膝關(guān)節(jié)縱行切開皮膚，肌肉、關(guān)節(jié)囊滑膜和纖維層分離，暴露出滑膜組織。無菌取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剔除脂肪和纖維，用含雙抗(100 IU/ml青霉素，100 IU/ml鏈霉素)的PBS反復(fù)沖洗后切成1～2 mm3小塊，均勻排列在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底壁(用含有20% FBS的DMEM培養(yǎng)基預(yù)先潤濕)，將培養(yǎng)瓶底部向上在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃溫育3 h。待細(xì)胞黏附在壁上后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻正(底部向下)，培養(yǎng)基剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3 d換1次培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞形態(tài)的變化，得到大量的成纖維細(xì)胞后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長至80%左右，用含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3代FLS進(jìn)行實驗。

1.2.5樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)培養(yǎng) 取正常大鼠和AA大鼠股骨及脛骨，在超凈臺中將兩端骨骺剪去暴露出骨髓腔，RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌骨髓腔，過200目紗網(wǎng)，離心收集骨髓細(xì)胞，接種于6孔板(2×106個細(xì)胞/孔)，將6孔板在培養(yǎng)箱溫育2～3 h后棄去上清液。沿著壁緩慢加入2 ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，AA大鼠骨髓細(xì)胞中加入細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4終濃度均為20 ng/ml，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng); 48 h后半量換液，并加入足量的細(xì)胞因子。第6天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC，并用脂多糖(LPS)(終濃度100 ng/ml)刺激24 h。第7天收集的細(xì)胞為成熟的DC。

1.2.6DC成熟試驗 AADC中加入CK(1 μmol/L)和RU486(10 μmol/L),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入抗CD40、CD80、CD86和MHCⅡ熒光抗體，并設(shè)同型對照組。貝克曼(Beckman)流式細(xì)胞儀檢測這些分子的表達(dá)以反映DC的成熟。

1.2.7T細(xì)胞與FLS共培養(yǎng) AA大鼠FLS加入CK(1 μmol/L)以及RU486(10 μmol/L)預(yù)處理6 h，收集細(xì)胞，離心(2 000 r/min，10 min)，以300 μl DMEM培養(yǎng)液重懸，與正常大鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)，F(xiàn)LS ∶T細(xì)胞的數(shù)量為1 ∶20，Beckman流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)，并設(shè)同型對照組。

1.2.8T細(xì)胞和DC共培養(yǎng) 用CK(1 μmol/L)和RU486(10 μmol/L)預(yù)處理AA大鼠的DC，與正常大鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)，按DC ∶T細(xì)胞的數(shù)量為1 ∶20。Beckman流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)，反映DC活化T細(xì)胞能力，并設(shè)同型對照組。

2 結(jié)果

2.1CK對ConA誘導(dǎo)的AA大鼠T細(xì)胞增殖的影響ConA誘導(dǎo)的AA大鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)(0.636±0.175)較正常大鼠T細(xì)胞增殖反應(yīng)(0.477±0.042)明顯增高。CK(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)體外給藥能明顯抑制AA大鼠T細(xì)胞的增殖，GR拮抗劑RU486(10 μmol/L)可以阻斷CK(10 、100 nmol/L)的作用，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.19，P<0.05)，提示CK對T細(xì)胞增殖的抑制作用可能與GR的活化有關(guān)；然而，GR拮抗劑RU486(1、10 μmol/L)對CK(1、10 μmol/L)引起的T細(xì)胞的增殖的抑制作用沒有影響，提示除了活化GR以外，高濃度的CK可能還通過其他途徑抑制T細(xì)胞的增殖(圖1)。

2.2CK對AA大鼠FLS誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的影響AA大鼠FLS與分離純化的正常T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，流式結(jié)果顯示T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)增加(3 396.5±144.957)，AA大鼠FLS加入CK(1 μmol/L)后與分離純化的T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)明顯減少(2 889.6±214.183)，而GR拮抗劑RU486(10 μmol/L)可以阻斷CK對T細(xì)胞活化的抑制作用(3 435.3±271.482),各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.19，P<0.05)(圖2)。

圖1 CK對AA大鼠T細(xì)胞增殖的影響

與正常組比較：#P<0.05；與AA組比較：*P<0.05,**P<0.01；與CK 10 nmol/L組比較：ΔP<0.05；與CK 100 nmol/L組比較：▽P<0.05

圖2 CK對AA大鼠滑膜細(xì)胞誘導(dǎo)正常T細(xì)胞活化的影響

A：流式細(xì)胞術(shù)測定T細(xì)胞表面CD25；B：各組平均熒光強(qiáng)度；與正常T細(xì)胞比較：#P<0.05；與AA FLS+正常T細(xì)胞比較：*P<0.05；與CK+AA FLS+正常T細(xì)胞比較：ΔP<0.05

圖3CK對AA大鼠DC細(xì)胞誘導(dǎo)正常大鼠T細(xì)胞活化的影響

A：CK對DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖作用的影響；B：流式細(xì)胞術(shù)測定T細(xì)胞表面CD25；C：各組平均熒光強(qiáng)度；與正常T細(xì)胞比較：#P<0.05，##P<0.01；與AA DC+正常T細(xì)胞比較：*P<0.05；與CK+AA DC +正常T細(xì)胞比較：ΔP<0.05

2.3CK對AA大鼠DC細(xì)胞誘導(dǎo)的大鼠T細(xì)胞活化的影響AA大鼠的DC可以明顯促進(jìn)正常T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)增加(1.317±0.108)，CK(1 μmol/L)體外作用于AA大鼠DC后與正常T細(xì)胞共培養(yǎng)，可以顯著抑制DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖作用(1.050 4±0.399)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.958，P<0.05)，減少DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)，GR拮抗劑RU486(10 μmol/L)可以阻斷CK(1 μmol/L)對DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞的抑制作用(1.317±0.137)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.311，P<0.05)(圖3)。CK(1 μmol/L)體外給藥能明顯抑制AA大鼠DC細(xì)胞表面分子(CD40、CD80、CD86、MHCⅡ)的表達(dá)，GR拮抗劑RU486(10 μmol/L)可以阻斷CK(1 μmol/L)對上述分子(CD40、CD86)表達(dá)的抑制作用，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(CD40：F=15.123，P<0.05；CD86：F=22.624，P<0.05)(圖4)。

3 討論

人參皂苷是人參成分中最有效的藥用成分，按照骨架類型可分達(dá)瑪烷型(包括原人參二醇型和原人參三醇型皂苷)和齊墩果型皂苷(R0、Rh3)兩種。研究[11-14]顯示這些人參皂苷單體的抗炎作用與核受體及其介導(dǎo)的信號有關(guān)，包括過氧化物酶體增殖物激活受體、雌激素受體、GR、肝X受體、孤兒受體等，這些核受體與炎癥和免疫密切相關(guān)，已經(jīng)成為治療炎癥免疫性疾病的靶點。

糖皮質(zhì)激素具有廣泛的免疫抑制作用，可以通過多種免疫細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制作用，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的分化活化；提高Treg的數(shù)量，促進(jìn)其功能；減少粒細(xì)胞數(shù)量；抑制樹突細(xì)胞的分化以及炎性細(xì)胞因子的分泌；抑制巨噬細(xì)胞分泌；抑制B細(xì)胞分泌抗體。糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎作用而被用于治療炎癥性疾病，也包括用于RA的治療[15]。糖皮質(zhì)激素通過與GR結(jié)合、激活GR，GR進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過結(jié)合靶基因序列，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，還可以與胞質(zhì)蛋白發(fā)生相互作用，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。CK在結(jié)構(gòu)上具有類似糖皮質(zhì)激素樣的甾環(huán)結(jié)構(gòu)，其抗炎免疫調(diào)節(jié)作用是否與核受體及其介導(dǎo)的信號有關(guān)？有文獻(xiàn)報道[10],CK可以與GR結(jié)合，誘導(dǎo)GR的活化。為了驗證GR是否是CK作用的靶點，本研究利用GR的拮抗劑RU486對滑膜細(xì)胞、T細(xì)胞、DC細(xì)胞進(jìn)行了探討。

圖4 CK對DC細(xì)胞成熟的影響

A、B、C、D:分別為流式細(xì)胞術(shù)測定DC細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的表達(dá)； E、F、G、H：分別為CD40、CD80、CD86、MHCⅡ平均熒光強(qiáng)度；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與AA組比較：*P<0.05；與CK 1 μmol/L組比較：ΔP<0.05

T細(xì)胞的異常激活是RA免疫異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。T細(xì)胞活化、分化成效應(yīng)T細(xì)胞，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞的增殖以及骨質(zhì)破壞。前期研究[7-9]已經(jīng)顯示CK對AA和CIA異常的T細(xì)胞增殖和活化有抑制作用，CK可以下調(diào)共刺激分子CD28和TCR，上調(diào)共抑制分子CTLA4和PD1，減少T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)和IL2的分泌；上調(diào)初始T細(xì)胞數(shù)量，下調(diào)活化T細(xì)胞數(shù)量，同時上調(diào)Treg的數(shù)量。而且CK可以減少CCL21/CCR7介導(dǎo)的DC向淋巴結(jié)的遷移，減少DC提供的T細(xì)胞活化的共刺激信號，抑制T細(xì)胞的活化。本研究表明CK對AA異常的T細(xì)胞增殖的抑制作用，對T細(xì)胞表面活化分子CD25的表達(dá)的抑制作用，都可以被GR拮抗劑RU486阻斷，這些結(jié)果提示CK對T細(xì)胞活化的抑制作用與活化GR有關(guān)，可能是GR依賴的。而且CK可以通過抑制FLS與T細(xì)胞的相互作用以及DC與T細(xì)胞的相互作用，從而抑制FLS或者DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化，而且此作用與活化FLS以及DC的GR有關(guān)。

綜上所述，CK可能通過多個環(huán)節(jié)發(fā)揮對T細(xì)胞活化的抑制作用，包括直接抑制T細(xì)胞的活化，以及抑制FLS和DC對T細(xì)胞的活化，CK的這些作用與GR的活化有關(guān)，GR可能是CK發(fā)揮作用的靶點。本研究顯示GR拮抗劑RU486對高濃度CK(10 μmol/L)引起的T細(xì)胞的增殖的抑制作用沒有影響，提示除了活化GR以外，高濃度的CK可能還通過其他途徑抑制T細(xì)胞的增殖。除GR以外，許多核受體與炎癥和免疫的密切相關(guān)，已經(jīng)成為治療炎癥免疫性疾病的靶點。這些核受體包括過氧化物增殖酶激活受體、肝X受體、雌激素受體、孤兒受體等。研究[11-14]顯示一些人參皂苷單體Rb1、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rh2、Rg3的抗炎作用與過氧化物酶體增殖物激活受體、雌激素受體、GR相關(guān)。CK作為人參人腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，除了活化GR之外，是否也能通過其他核受體發(fā)揮作用，仍需要進(jìn)一步的研究。