汪 洋，鮑得俊，程傳東，董永飛，魏祥品，牛朝詩，傅先明，汪業(yè)漢

介入手術(shù)是治療心腦血管疾病重要手段, 但術(shù)后引起的血管內(nèi)膜損傷后再狹窄是困擾介入治療的難題[1], 而內(nèi)膜增生(intimal hyperplasia，IH)是血管介入術(shù)后再狹窄的病理基礎(chǔ)[2]。研究[3]顯示血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)凋亡減弱了血管內(nèi)皮層的屏障作用，加速斑塊的形成。ECs凋亡后，又可以啟動凝血機制在病變局部形成血栓，加重血管腔狹窄[4]。目前，一些相應(yīng)的抑制ECs凋亡的藥物被應(yīng)用到臨床。硫辛酸胺 (α-lipoic acid-plus，LAP) 是硫辛酸(α-lipoic acid，LA)的衍生物，可抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)引起的氧化應(yīng)激，進而抑制神經(jīng)細胞的凋亡，與最常見的抗氧化劑LA相比，LAP的抗凋亡作用更強[5]。該研究擬通過球囊壓迫法建立頸動脈內(nèi)膜損傷動物模型，再予以LAP干預(yù)，探討LAP對IH的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒購自美國Sigma公司；LAP由大連美侖生物科技有限公司合成，純度100%。Western blot和免疫熒光一抗：Cathepsin B/D、Caspase-3購自英國Abcam公司；Western blot二抗：HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；免疫熒光二抗：Alexa Fluor-488 donkey anti-rabbit IgG 抗體、Alexa Fluor-488 donkey anti-goat IgG 抗體購自美國Invitrogen公司。

1.2實驗動物成年健康雄性SD大鼠由上海實驗動物研究中心提供，雄性，300～350 g。所有動物實驗遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，術(shù)前單籠飼養(yǎng)，保持室溫18～22 ℃，自由飲食飲水，安靜、避光環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立 10%水合氯醛(藥物效量：4 ml/kg)對SD大鼠進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠仰臥于操作臺上，頸部去毛備皮，安爾碘常規(guī)消毒。正中偏右0.5 cm切開皮膚，切開頸前肌，牽開胸鎖乳突肌，找到頸動脈分叉處，游離頸內(nèi)、頸外、頸總動脈。顯微鏡下血管夾夾住頸總動脈，在頸外動脈上剪開一個缺口，球囊裝置塞入缺口沿著管腔一直到達頸總，松開血管夾，球囊裝置繼續(xù)向前，大約離分叉處2 cm左右，注射器注水使球囊充盈，關(guān)閉閥門，然后沿著管腔來回滑動3次，造成頸動脈內(nèi)膜損傷。抽出球囊中的水，退出導管，顯微鏡下縫合頸外動脈上的缺口[6]。

1.3.2實驗分組和處理 SD大鼠48只，隨機分為4組，假手術(shù)組：12只，只分離頸動脈；血管損傷組：12只，顯微鏡下利用球囊壓迫法建立大鼠頸動脈損傷模型；LAP低劑量組：12只，模型建立后6 h，將LAP(100 mg/kg)與2 ml的甲基纖維素(濃度為0.5%)混合，通過胃管給藥，連續(xù)3 d，每天給藥一次；LAP高劑量組：12只，模型建立后6 h，將LAP(150 mg/kg)與2 ml的甲基纖維素(濃度為0.5%)混合，通過胃管給藥，連續(xù)3 d，每天給藥一次。

1.3.3氧化應(yīng)激水平的測定 用ROS、MDA、SOD、GSH-Px試劑盒來進行氧化應(yīng)激水平的測定。顯微鏡下剝除損傷區(qū)域血管內(nèi)皮層，加入適量生理鹽水研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，分別用作ROS、MDA、SOD、GSH-Px的分析，勻漿中的蛋白濃度由考馬斯亮藍法試劑盒測定。ROS含量的測定選用ROS檢測探針DCF-DA，混合液的熒光強度由熒光酶標儀(FilterMax F5, Molecular Devices)來測定，最佳激發(fā)波長為485 nm，最終的ROS的測定結(jié)果以熒光強度/mg蛋白表示，根據(jù)試劑盒中提供的步驟，類似地測定MDA含量、SOD、GSH-Px的活性。

1.3.4Western blot法 顯微鏡下取適當長度的頸動脈內(nèi)皮研磨，加入裂解液，離心，4 ℃過夜；Bradford比色法測定總蛋白濃度；制膠，15%分離膠，5%濃縮膠；蛋白樣品100 ℃變性5 min，上樣30 μg；恒壓60 V進膠，當溴酚藍前沿剛進入分離膠后，恒壓100 V跑膠；用轉(zhuǎn)移槽恒流轉(zhuǎn)膜，2 h；用麗春紅染液將PVDF膜染色，據(jù)目標蛋白分子量將膜進行適當剪切；用PBS浸泡使膜上的麗春紅顏色褪去；用含5% BSA的PBST溶液在室溫下封閉1 h；用含3 % BSA的PBST溶液稀釋一抗(1 ∶1 000)，與含目標蛋白的PVDF膜在4 ℃孵育過夜；用PBST浸泡膜1次，10 min；用PBS浸泡膜2次，每次10 min；用PBS稀釋二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；用PBS浸泡膜3次，每次10 min；ECL 化學發(fā)光底物法暗室中顯色；掃描保存實驗結(jié)果，用QUANTITY ONE(v4.6.2)凝膠電泳圖象分析軟件，分析結(jié)果。

1.3.5免疫熒光共染 取4 μm的血管石蠟切片,70 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟水化；切片置于10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中行抗原修復，微波爐加熱(95 ℃)，30 min，自然冷卻至室溫；PBS浸泡3次，每次5 min；0.2% TRItion X-100透化2 min；PBS浸泡3次，每次5 min；0.5%天空藍浸泡10 min；PBS浸泡3次，每次5 min ；10%血清封閉液封閉20～30 min；加一抗(1 ∶100)4 ℃過夜；恢復室溫，PBST浸泡3次，每次5 min；加相應(yīng)二抗(1 ∶200)37 ℃孵育30 min～1 h(避光)，恢復室溫，PBST浸泡3次，每次5 min；防淬滅封片劑封片；共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6HE染色 取4 μm的血管石蠟切片,70 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟水化；梯度酒精脫脂。將切片依次放入100%、95%、80%乙醇中各3 min，最后放入自來水中2 min；蘇木精染色30 s；蒸餾水洗片2 min；0.5%鹽酸酒精分化3 s；自來水洗片2 min； 80% 乙醇中15 s；伊紅染色1 min(不可超時)；蒸餾水速洗；脫水，將切片依次放入80%、95%、100%乙醇中各15 s，最后放入二甲苯中10 min；將切片放置通風櫥中干燥，滴加中性樹脂封片；顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7TUNEL染色 根據(jù)TUNEL試劑盒實驗步驟進行染色：① 取4 ～ 6 μm的石蠟切片，預(yù)熱70 ℃烤片2 h， 在二甲苯及梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)溶液中脫蠟；② 預(yù)處理：在37 ℃避光保溫箱中，切片浸沒孵育在蛋白酶K溶液(10～20 μg/ml in 10 mol/L TRIs/HCl，pH 7.4～8)浸泡30 min；③ PBS溶液沖洗3次，每次5 min；④ 在37 ℃的避光保溫箱中，滴加TUNEL工作溶液，孵育60 min；⑤ PBS溶液沖洗3次，每次5 min；⑥ 暗室中常溫風干，滴加抗淬滅熒光封片劑，加蓋玻片封存。

2 結(jié)果

2.1損傷血管氧化應(yīng)激水平測定假手術(shù)組中ROS、MDA水平很低，而損傷組ROS、MDA水平顯著上升，為對照組的(1.370±0.101)、(1.432±0.089)倍(F=12.32、10.14，P<0.05)；干預(yù)組中，LAP能顯著抑制ROS、MDA 的上調(diào)，為損傷組的(0.784±0.081)、(0.681±0.078)倍(F=7.75、P<0.05，F(xiàn)=14.67、P<0.01)；同時SOD、 GSH-Px在損傷后活性顯著下降，為對照組的(0.509±0.213)、(0.588±0.093)倍(F=22.69、P<0.01，F(xiàn)=24.35、P<0.01)，但LAP能顯著抑制SOD、GSH-Px的下調(diào)，為損傷組的(1.364±0.112)、(1.417±0.056)倍(F=7.45、P<0.05，F(xiàn)=16.78、P<0.01)，其變化趨勢與ROS、MDA含量的變化趨勢相反。不同劑量的LAP抗氧化應(yīng)激的能力無明顯差異，見圖1。

2.2血管內(nèi)皮組織中的CathepsinB/D、Caspase-3的表達Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，損傷組內(nèi)皮組織中CathepsinB/D，Caspase-3的蛋白水平明顯上升(F=19.35、P<0.01，F(xiàn)=23.65、P<0.01，F(xiàn)=7.86、P<0.05)，LAP能夠顯著抑制CathepsinB/D，Caspase-3的水平(F=21.73、P<0.01，F(xiàn)=11.54、P<0.05，F(xiàn)=8.95、P<0.05)；高劑量的LAP較低劑量LAP能發(fā)揮更強的效應(yīng)(F=9.39，P<0.05，F(xiàn)=17.15、P<0.01)，見圖2。利用免疫熒光方法檢測了血管內(nèi)皮層中CathepsinB/D表達，損傷組中內(nèi)皮組織中CathepsinB/D的表達較假手術(shù)組輕度增多，但應(yīng)用LAP干預(yù)后，內(nèi)皮組織中的CathepsinB/D顯著下調(diào)，見圖3、4。

2.3TUNEL染色結(jié)果與假手術(shù)組比較，損傷組內(nèi)皮層中的ECs凋亡率顯著升高(F=14.35，P<0.01)，LAP處理顯著地降低了ECs的凋亡率(F=7.76、P<0.05，F(xiàn)=25.63、P<0.01)。驗證了LAP通過抑制凋亡，保護ECs的作用，見圖5。

2.4HE染色結(jié)果血管損傷后3周，損傷節(jié)段血管內(nèi)可見明顯的內(nèi)膜增厚，有效管腔面積低于假手術(shù)組，為假手術(shù)組的(0.764±0.201)倍(F=17.84，P<0.01)，LAP可顯著被抑制IH，有效抑制管腔狹窄，為損傷組的(1.231±0.359)倍(F=7.26，P<0.05)。結(jié)果表明LAP能夠抑制損傷血管IH及管腔狹窄，見圖6。

3 討論

內(nèi)皮損傷是介入治療的特異性損傷，也是一種嚴重的并發(fā)癥，內(nèi)皮損傷與血管內(nèi)血栓和再狹窄形成密切相關(guān)，而促進血管內(nèi)皮再生，短時間內(nèi)恢復內(nèi)皮完整性有助于預(yù)防血管再狹窄。當血管內(nèi)皮損傷后，延遲性再內(nèi)皮化和IH將會變得不可避免，同時對血管的再狹窄率和血栓的形成發(fā)揮很大的作用。目前，文獻[7]報道已經(jīng)有很多有效的干預(yù)措施及藥物來預(yù)防血管損傷后的IH。例如，血管周圍應(yīng)用雷帕霉素可對血管IH呈現(xiàn)持續(xù)的抑制作用。在損傷血管局部使用胰島素可顯著減少增生內(nèi)膜的厚度，增加管腔面積而不影響全身的血糖水平，同時平滑肌細胞的增殖和遷移受到了抑制，因此，胰島素涂支架對血管內(nèi)手術(shù)后的再狹窄提供了保護效應(yīng)[8]。近年來，ECs凋亡引起延遲再內(nèi)皮化引起了重視，有多種信號通路參與ECs凋亡，如Ox-LDL可通過PERK/eIF2α/CHOP ER-stress信號通路誘導ECs凋亡[9]。有文獻[10]證實內(nèi)皮抑素特異性抑制ECs生長、遷移，誘導ECs凋亡，抑制損傷血管的再內(nèi)皮化，參與了再狹窄形成。另外，有文獻[11]證實姜黃素可抑制ECs的凋亡來促進血管損傷區(qū)域再內(nèi)皮化，繼而抑制血管IH。在前期研究中，Svensson et al[12]已經(jīng)在實驗中論證了miR-125a在ECs中過表達可抑制ECs的增殖和分化，同時下調(diào)Bcl-2 和Caspase-3蛋白水平，激活內(nèi)部凋亡通路，加速ECs的凋亡，因此，應(yīng)用miR-125a 抑制劑可能是增加ECs增殖及分化，促進血管損傷后再內(nèi)皮化的一種重要方法。當血管內(nèi)皮損傷后，部分紅細胞粘滯在受損的內(nèi)皮層，繼而發(fā)生分解產(chǎn)生血紅蛋白，血紅蛋白的分解產(chǎn)物亞鐵血紅素在血紅素加氧酶的作用下生成二氧化碳和膽綠素，隨之生成具有催化作用的活性鐵，此反應(yīng)中通過Fenton反應(yīng)也有大量的ROS的產(chǎn)生[13]。Yu et al[14]前期試驗已經(jīng)證實細胞的溶酶體內(nèi)存在一個不穩(wěn)定、氧化活性鐵池，如果細胞遭受到外界氧化應(yīng)激損傷時，溶酶體內(nèi)鐵將會增加細胞損傷的危險。同時，筆者在之前的試驗中證實了SAH后早期腦損傷與神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞的凋亡密切相關(guān)，其具體表現(xiàn)為SAH后神經(jīng)細胞內(nèi)溶酶體膜的通透性增加，破裂的溶酶體數(shù)目增多，釋放的Cathepsins將進一步級聯(lián)放大溶酶體外的凋亡信號。但這一過程可能有自由鐵的參與，溶酶體酸性環(huán)境和高水平的自由鐵促進了Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生了氧化能力更強的羥自由基，損傷并破壞溶酶體膜。而一種親溶酶體內(nèi)鐵的螯合劑LAP，作為LA的衍生物，結(jié)構(gòu)中含有巰基，可靶向與溶酶體內(nèi)鐵反應(yīng)，穩(wěn)定溶酶體膜，抑制Cathepsins介導的凋亡通路，減輕神經(jīng)細胞的凋亡，起到腦保護的作用[5]。眾所周知，溶酶體和Cathepsins能級聯(lián)放大溶酶體外的凋亡信號在多種疾病中已經(jīng)被證實[15]。

圖1 損傷血管的氧化應(yīng)激水平

A：ROS；B：MDA；C：SOD；D：GSH-Px; 1:假手術(shù)組；2：血管損傷組；3：LAP低劑量組；4：LAP高劑量組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05,##P<0.01；與低劑量組比較：&P<0.05

圖2 Western blot檢測CathepsinB/D和Caspase-3的表達水平

A：Cathepsin B; B:Cathepsin D; C:Caspase-3; 1:假手術(shù)組；2：血管損傷組；3：LAP低劑量組；4：LAP高劑量組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05,##P<0.01；與低劑量組比較：&P<0.05

圖3 免疫熒光法檢測Cathepsin B的表達水平×400

A：假手術(shù)組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組

圖4 免疫熒光法檢測Cathepsin D的表達水平 ×100

A：假手術(shù)組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組

圖5 TUNEL染色標記凋亡的內(nèi)皮細胞 ×400

A：假手術(shù)組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與血管損傷組比較：##P<0.01，#P<0.05；與LAP低劑量組比較：&P<0.05

圖6 HE染色評估內(nèi)膜增生及管腔狹窄情況 HE×100

A：假手術(shù)組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05

綜上所述，ECs凋亡在血管內(nèi)膜損傷后再內(nèi)皮化及IH過程中受到廣泛重視，一些相應(yīng)抑制ECs凋亡的藥物被應(yīng)用到臨床。但在血管內(nèi)膜損傷中，Cathepsins介導的ECs凋亡通路卻很少被探討，本次實驗結(jié)果提示當血管內(nèi)膜損傷72 h后，損傷血管內(nèi)皮層的氧化應(yīng)激水平、CathepsinB/D、Caspase-3的表達水平及ECs凋亡率明顯上調(diào)，但LAP能顯著抑制氧化應(yīng)激水平、ECs凋亡率及上述蛋白的表達；當血管內(nèi)膜損傷3周后，HE染色結(jié)果顯示損傷節(jié)段血管可見明顯的內(nèi)膜增厚，導致管腔狹窄。而LAP可顯著抑制IH，減輕血管腔的狹窄。因此，LAP抑制大鼠頸動脈球囊損傷后IH，其可能機制為LAP不僅因為其抗氧化的特性，還特異性抑制溶酶體內(nèi)Cathepsins介導的凋亡通路，減少ECs的凋亡，加速損傷區(qū)域內(nèi)皮修復，從而抑制IH。因此，像此類能抑制溶酶體內(nèi)Cathepsins的藥物，將會成為治療血管內(nèi)膜損傷中延遲再內(nèi)皮化及內(nèi)膜過度增生的一種新的策略。