耿鵬程，張繼千，譚其蓮，程 丹，戴 偉，劉學(xué)勝

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年癡呆的主要病因，以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要臨床特征[1]。研究[2]表明自噬功能受損參與AD病理過程，AD大腦中突觸功能受損可能是AD學(xué)習(xí)記憶障礙的原因[3]。術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是一種常見的手術(shù)麻醉后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為焦慮、精神錯(cuò)亂以及學(xué)習(xí)記憶功能下降等[4]。POCD與AD都有學(xué)習(xí)記憶功能障，并且大量實(shí)驗(yàn)室研究[5]表明麻醉后大腦中AD病理標(biāo)志物β淀粉樣蛋白(β amyloid,Aβ)產(chǎn)生增多；已經(jīng)出現(xiàn)AD病理變化的大腦在麻醉后會(huì)出現(xiàn)怎樣的變化，通過前期研究[6]顯示AD模型小鼠吸入七氟烷后的確出現(xiàn)認(rèn)知功能進(jìn)一步減退，但是其具體機(jī)制還不清楚，該實(shí)驗(yàn)主要探討七氟烷麻醉后AD小鼠海馬中Aβ表達(dá)、突觸和自噬功能的變化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只、6～7月齡、雄性、SPF級(jí)、APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠購自南京大學(xué)動(dòng)物模式中心，體質(zhì)量35～43(39.6±2.5)g。所有小鼠飼養(yǎng)在溫度、濕度、燈光受調(diào)控的房間，食物和水充足。

1.1.2主要試劑及來源 Aβ抗體(免疫印跡1 ∶1 000，免疫熒光1 ∶100，ab11132)、p62抗體(1 ∶1 000，ab56416)、Alexa Fluor 568(1 ∶500，ab175473) 和Alexa Fluor 488(1 ∶500，ab150077)購自英國Abcam公司；突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95)抗體(1 ∶1 000，3409S)購自美國CST公司； LC-3抗體(熒光1 ∶2 000，免疫印跡1 ∶200，NB100-2220)購自美國Novus Biologicals公司；溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)(1 ∶100，sc20011)購自美國Santa Cruz公司；BCA試劑盒(P0010S)購自上海碧云天生物公司。

1.1.3主要儀器 Olympus BX53熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；Amersham Imager 600凝膠成像儀(美國通用公司)；Allegra64R離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；Morris水迷宮系統(tǒng)(上海吉量軟件科技公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及麻醉藥物處理 APP/PS1小鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(n=16)和七氟烷組(n=16)。小鼠置于20 cm×8 cm×8 cm透明自制麻醉箱內(nèi)，盒兩端各有一小孔，一端接七氟烷麻醉揮發(fā)罐輸入60%空氧混合氣(60%氧氣、40%氮?dú)?和七氟烷(日本Maruishi Pharmaceutica公司)，另一端接麻醉氣體監(jiān)測儀(0hmeda,美國Detax公司)監(jiān)測麻醉氣體和氧氣濃度。七氟烷組吸入3%七氟烷4 h，載氣為60%空氧混合氣，流量3 L/min，結(jié)束后載氣洗脫15 min。麻醉過程中，麻醉箱外包裹加熱毯，溫度探頭檢測小鼠直腸溫度，維持溫度37～38 ℃，維持小鼠自主呼吸。對(duì)照組置于麻醉箱內(nèi)，不吸入七氟烷，只吸入60%空氧混合氣4 h，流量為3 L/min。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 吸人七氟烷或氧氣后24 h，各組隨機(jī)取10只小鼠，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮為圓形水池直徑為120 cm，高60 cm，平臺(tái)高度50 cm，直徑10 cm，平臺(tái)低于水面1 cm，池壁放置參照物，平臺(tái)屏蔽劑為白色二氧化鈦。水槽等分為4個(gè)象限，水槽中心上方放置攝像頭計(jì)時(shí)跟蹤小鼠游泳軌跡。實(shí)驗(yàn)期間參照物保持不變，保持安靜，水溫20～22 ℃。水迷宮實(shí)驗(yàn)共需5 d，第1～4 天為訓(xùn)練期，第5天為空間探索實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練期每只小鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，4次/d，每次間隔10 min讓小鼠休息，記錄小鼠分別從4個(gè)象限找到平臺(tái)所需的時(shí)間。若90 s內(nèi)小鼠未找到平臺(tái)，引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)，時(shí)間計(jì)為90 s。取4次找到平臺(tái)所需時(shí)間的平均值作為潛伏期(escape latency)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：去除平臺(tái)，將小鼠從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限面向池壁放入水中，記錄90 s內(nèi)小鼠在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間(target quadrant time)和穿臺(tái)次數(shù)(platform crossing times)，計(jì)算平臺(tái)所在原象限停留時(shí)間百分比(目標(biāo)象限停留時(shí)間÷90×100%)。

1.2.3Western blot 吸入氧氣或者七氟烷后24 h，每組5只小鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉后斷頭取腦，冰上分離出海馬組織，置于冷凍管中放入液氮速凍保存。將取出的海馬加入裂解液中裂解，冰上玻璃勻漿器勻漿1 min，離心后取上清液，分裝，加入樣品緩沖液并煮沸10 min，通過BCA法定量。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白，將電泳后的凝膠與NC膜疊在一起，在350 mA條件下轉(zhuǎn)移至膜上，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，之后加入一抗4 ℃過夜，次日在搖床上用TBST洗膜3次，之后加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，將ECL顯色液加入膜上并在凝膠成像儀下顯影。

1.2.4免疫熒光 經(jīng)左心室注入PBS緩沖液，剪開右心耳使血液流出，灌注PBS 30 ml后注入4%多聚甲醛，隨后完整取出大腦，放入4%多聚甲醛中固定4 h，之后30%蔗糖脫水過夜，在冰凍切片機(jī)(SLEE，德國)下切取8 μm冠狀面大腦切片，PBS浸洗10 min后再用0.1%TritonX-100透膜7 min，TBST洗3次后，用2%BSA(牛血清蛋白)封閉1 h，加入一抗4 ℃條件下孵育過夜，次日TBST洗3次，后加入二抗，在37 ℃孵育1 h，TBST洗3次后使用DAPI染核7 min，TBST洗3次后，80%甘油封片，通過共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1七氟烷影響APP/PS1小鼠認(rèn)知能力APP/PS1小鼠進(jìn)行連續(xù)5 d水迷宮實(shí)驗(yàn)，前4天為訓(xùn)練期，經(jīng)過重復(fù)測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析，對(duì)照組和七氟烷組的平均逃避潛伏期在組間(對(duì)照組vs七氟烷組)和時(shí)間上的交互作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.84，P<0.01)，事后檢驗(yàn)表明訓(xùn)練第3天和第4天平均逃避潛伏期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第3天：44.9 s±10.1 svs69.7 s±11.5 s，P<0.001；第4天：38.2 s±11.9 svs60.8 s±13.7 s，P<0.001)，七氟烷組表現(xiàn)為更長的潛伏期；見圖1A。兩組小鼠在游泳速度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.167 m/s±0.035 m/svs0.163 m/s±0.036 m/s,P>0.05)，排除運(yùn)動(dòng)能力對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，見圖1B。第5天為探索實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組和七氟烷組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比(25.8%±5.93%vs17.8±4.75%，P<0.05)和穿臺(tái)次數(shù)(1.8±1.03次vs0.8±0.63次，P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，七氟烷組目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿臺(tái)次數(shù)更少，見圖1C、1D。

2.2七氟烷影響APP/PS1小鼠海馬PSD95表達(dá)PSD95是維持突觸后部功能的一個(gè)重要的蛋白，Western blot結(jié)果表明對(duì)照組與七氟烷組APP/PS1小鼠海馬中PSD95水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組小鼠海馬中PSD95明顯高于七氟烷組，見圖2。

2.3七氟烷影響APP/PS1小鼠海馬細(xì)胞內(nèi)Aβ表達(dá)淀粉樣蛋白前體通過β和γ淀粉酶剪切形成大量Aβ沉積是AD病理特征之一，Western blot表明對(duì)照組和七氟烷組APP/PS1小鼠海馬中Aβ水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，七氟烷明顯增加Aβ水平，見圖3。

2.4七氟烷對(duì)APP/PS1小鼠海馬自噬水平影響微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule related protein light chain 3,LC3)是自噬體的標(biāo)志物，當(dāng)自噬過程被激活，LC3Ⅰ被剪切行成分子量較小的LC3Ⅱ，并且聚集到自噬體膜表面，進(jìn)而包裹待降解物形成完整的自噬體。Western blot結(jié)果表明，對(duì)照組和七氟烷組APP/PS1小鼠海馬中LC3Ⅱ蛋白水平(P<0.01)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，七氟烷組LC3Ⅱ水平明顯增多，見圖4。

圖1 3%七氟烷麻醉4 h對(duì)APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響

A:兩組小鼠連續(xù)4 d訓(xùn)練期平均逃避潛伏期；B:兩組小鼠游泳速度；C:第5天的探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠在90 s內(nèi)目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比；D:探索實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)；與對(duì)照組比較：*P<0.05，***P<0.001

圖2 60%氧氣或3%七氟烷麻醉4 h后APP/PS1小鼠海馬中PSD95表達(dá)

A：PSD95和β-actin的免疫印跡條帶；B：PSD95光密度值標(biāo)準(zhǔn)化后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖3 兩組小鼠海馬中Aβ表達(dá)

A: Aβ和β-actin免疫印跡條帶；B:Aβ光密度值標(biāo)準(zhǔn)化后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖4 兩組小鼠海馬中LC3表達(dá)水平

A: LC3Ⅱ、LC3Ⅰ及β-actin免疫印跡條帶；B:LC3Ⅱ光密度值標(biāo)準(zhǔn)化后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.5七氟烷影響溶酶體功能p62是自噬的的底物蛋白，LAMP1是溶酶體膜的標(biāo)志蛋白，通過免疫熒光染色及共聚焦顯微鏡觀察Aβ和LAMP1的位置，結(jié)果顯示兩種蛋白存在共定位(橙色熒光)，說明Aβ存在溶酶體中，見圖5A。通過Western blot檢測對(duì)照組和七氟烷組小鼠海馬中p62水平，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，七氟烷組p62明顯增多，見圖5B、5C。

圖5 Aβ與溶酶體共定位情況及兩組小鼠海馬中p62表達(dá)

A:共聚焦顯微鏡觀察Aβ和溶酶體共定位 ×400；藍(lán)色熒光：細(xì)胞核；紅色：Aβ；綠色：LAMP1；橙色：Aβ和LAMP1共定位(白色箭頭)；B: p62及β-actin的免疫印跡條帶；C: p62光密度值標(biāo)準(zhǔn)化后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

全身麻醉對(duì)大腦功能的影響一直是麻醉領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，由于患者的年齡、合并癥、手術(shù)類型、圍術(shù)期用藥以及對(duì)POCD診斷標(biāo)準(zhǔn)的不同等等，這些混淆因素都使得全身麻醉藥物與POCD的關(guān)聯(lián)充滿了不確定性。動(dòng)物研究[7]表明存在神經(jīng)退行性疾病的大腦更容易受到麻醉藥物的影響。七氟烷是目前臨床上最常用的吸入麻醉藥之一，有研究[8]表明POCD可能與臨床麻醉中應(yīng)用七氟烷有關(guān)。APP/PS1小鼠是一種APP和PS1突變基因共同表達(dá)的AD模型小鼠，在6～7月時(shí)大腦開始出現(xiàn)Aβ斑塊沉積，7月出現(xiàn)輕度認(rèn)知功能障礙，可用來模擬AD的發(fā)病過程[9]，該實(shí)驗(yàn)證明了3%七氟烷全身麻醉可以加重APP/PS1小鼠認(rèn)知功能障礙，說明存在AD風(fēng)險(xiǎn)的患者在七氟烷全麻后可能會(huì)加重或者加速AD的進(jìn)程。

突觸在學(xué)習(xí)記憶的形過程成中具有重要作用，PSD95是神經(jīng)元的支架蛋白，存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域，參與了細(xì)胞內(nèi)蛋白和蛋白之間的連接，PSD的厚度以及相變可能是突觸可塑性形成的基礎(chǔ)[10]。早在1998年就有研究[11]表明突變的PSD95可以損傷小鼠LTP和學(xué)習(xí)記憶能力。該研究表明七氟烷引起APP/PS1小鼠PSD95減少，可能是其認(rèn)知損傷的原因。在AD發(fā)展過程中，突觸功能受損與認(rèn)知功能障礙形成密切相關(guān)，老年斑的主要構(gòu)成成分Aβ可能具有突觸毒性，AD患者和AD模型動(dòng)物大腦中越靠近老年斑的突觸丟失越嚴(yán)重[12]。結(jié)合上述結(jié)果七氟烷引起海馬中Aβ增多可能是PSD95減少的原因。

自噬是真核細(xì)胞中非常重要的生物學(xué)過程，與人類的生理學(xué)和病理學(xué)過程密切相關(guān)，正常的自噬功能通過消化降解錯(cuò)誤折疊蛋白、損壞的細(xì)胞器及病原等物質(zhì)維持細(xì)胞功能以及抵御不利因素的傷害。胞質(zhì)中存在的均勻分布的LC3Ⅰ，在自噬體起始復(fù)合物開始形成后與磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)形成LC3Ⅱ，泛素化的蛋白通過LC3Ⅱ結(jié)合到自噬體上使自噬體延長， LC3Ⅱ蛋白的積累變化是反映自噬流的常用方法[13]。p62可以作為自噬的底物，p62蛋白通過LC3結(jié)合基團(tuán)連接LC3，并隨著自噬體在自噬溶酶體中降解，抑制自噬功能引起p62增多[14]。該實(shí)驗(yàn)顯示七氟烷麻醉的APP/PS1小鼠海馬中LC3和p62蛋白水平相比氧氣組小鼠明顯增多，說明七氟烷使自噬受損。在AD大腦中自噬功能受損導(dǎo)致Aβ降解受阻，細(xì)胞內(nèi)Aβ增多[2]。電針刺改善AD大腦中自噬功能有助于Aβ的降解，而阻斷自噬則削弱其作用[15]。3%七氟烷損傷自噬功能可能是七氟烷引起Aβ增多的原因。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3%七氟烷引起APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)Aβ升高、自噬和突觸功能受損；推測自噬受損引起Aβ增多，進(jìn)而減少PSD95水平損傷突觸功能可能是七氟烷引起APP/PS1小鼠記憶損傷的分子機(jī)制，接下來需要使用一些特異性阻斷劑或激活劑研究這些分子之間的關(guān)聯(lián)。