黃炯華，宋代富，區(qū)德錦，謝文杰，戴文軍

高血壓是心力衰竭的重要病因之一，其可以激活交感神經(jīng)分泌腎上腺素能體液因子，觸發(fā)心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1-3]和小樣本臨床試驗(yàn)[4-5]證實(shí)，經(jīng)雙側(cè)腎動(dòng)脈去交感神經(jīng)治療，可抑制腎交感神經(jīng)活性降低血壓減緩心臟肥厚的進(jìn)展。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6-7]顯示，雙側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)聯(lián)合美托洛爾或氯沙坦治療，能抑制自發(fā)性高血壓誘導(dǎo)的心肌肥厚。同時(shí)，既往血管緊張素Ⅱ刺激心肌細(xì)胞肥大模型實(shí)驗(yàn)[8]表明，抑制心肌細(xì)胞自噬可減輕心肌細(xì)胞肥大。然而，心肌自噬在雙側(cè)腎去神經(jīng)聯(lián)合氨氯地平治療高血壓心肌肥厚中的作用仍不明確。該研究擬通過(guò)自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚動(dòng)物模型，探討心肌自噬在腎去神經(jīng)聯(lián)合氨氯地平治療高血壓心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1材料SFP級(jí)8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat， SHR)大鼠24只，體質(zhì)量(142.17±11.35)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2016-0001；氨氯地平購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(MB1725)；RNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液NP-40及Western發(fā)光試劑購(gòu)自上海碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自瑞士羅氏公司；辣根過(guò)氧化物二抗購(gòu)自武漢博爾德公司；多功能泛素化結(jié)合的折疊蛋白(sequestosome1，SQSTM1/p62)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司。

1.2方法

1.2.1高血壓心肌肥厚動(dòng)物模型構(gòu)建及分組 參照先前關(guān)于自發(fā)性高血壓大鼠的實(shí)驗(yàn)[6]結(jié)果，12周齡的SHR可出現(xiàn)高血壓心肌肥厚改變。本實(shí)驗(yàn)以12周齡的SHR作為高血壓心肌肥厚的研究對(duì)象。依據(jù)是否進(jìn)行雙側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)治療，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(A組)、雙側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)+空白藥物對(duì)照組(B組)、雙側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)+氨氯地平組(C組)，共3組，每組8只動(dòng)物。

1.2.2動(dòng)物給藥途徑和參照的劑量 根據(jù)文獻(xiàn)[9]選定劑量，C組每天給予氨氯地平原藥(MB1725)10 mg/kg灌胃，A、B組的大鼠分別每天給予等體積生理鹽水和等劑量的空白對(duì)照藥物灌胃，連續(xù)4周。

1.2.3左室體重指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)的測(cè)定 干預(yù)治療4周，大鼠用烏拉坦麻醉處死后，快速獲取心臟，稱全心重(heart weight, HW)，并快速分離左心室并稱量(left ventricular weight, LVW)，以LVW與HW之比計(jì)算LVMI。

1.2.4心肌HE染色 干預(yù)治療4周，獲取大鼠的心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，心臟橫向切片，HE染色。組織切片顯微鏡觀察并拍圖。

1.2.5肥厚基因的表達(dá)的檢測(cè) 取100 mg左心室組織剪碎，用TRIzol試劑勻漿，抽提組織總RNA。用RT-PCR試劑盒檢測(cè)β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)和心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)的表達(dá)量。RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6自噬標(biāo)志蛋白定量測(cè)定 心肌組織收集后采用NP-40裂解液進(jìn)行抽提，蛋白濃度通過(guò)BCA法測(cè)定。約取樣品40 μg蛋白進(jìn)行電泳分離和轉(zhuǎn)膜。將承載有目的蛋白膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，然后加入單克隆抗體p62、LC3和GAPDH于4 ℃孵育過(guò)夜。孵育過(guò)夜的蛋白膜用PBS-T液洗滌后，加入免疫二抗進(jìn)行孵育免疫共沉淀反應(yīng)。免疫復(fù)合物通過(guò)曝光液進(jìn)行曝光獲取底片。蛋白相對(duì)表達(dá)量用內(nèi)對(duì)照蛋白GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算獲取。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心臟形態(tài)及局部病理結(jié)構(gòu)變化獲取心臟標(biāo)本，觀察形態(tài)變化；并行橫切面HE染色，觀察大鼠心肌組織局部的病理變化。結(jié)果表明，心臟形態(tài)比較可見(jiàn)B組、C組較A組小，以C組更明顯。HE染色：A組室壁較厚，心腔變小，向心性肥厚，B組、C組心室壁厚度明顯減小，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心臟形態(tài)及橫切面HE病理切片的改變 SP ×20

2.2各組大鼠LVMI的變化通過(guò)計(jì)算各組大鼠LVMI并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，A組、B組和C組LVMI分別為(4.43±0.83)×10-3、(3.21±0.61)×10-3及(2.22±0.65)×10-3，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.39，P<0.01)。其中與A組比較，B、C組的LVMI減低；與B組比較，C組降低更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠LVMI的變化與A組比較：△P<0.05；與B組比較：*P<0.05

2.3各組大鼠心肌肥厚基因表達(dá)的變化RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，A組、B組和C組ANP的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.03±0.13)、(0.6±0.06)及(0.41±0.07)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.39，P<0.01)；β-MHC的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.99±0.12)、(0.59±0.06)及(0.32±0.05)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.22，P<0.01)。其中與A組比較，B組和C組的ANP和β-MHC下調(diào)；與B組比較，C組下調(diào)更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 心肌組織肥厚基因(ANP和β-MHC)表達(dá)的變化與A組比較：△P<0.05；與B組比較：*P<0.05

2.4心肌自噬活性標(biāo)志蛋白的表達(dá)變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，A組LC3-Ⅱ的表達(dá)增加，B組和C組表達(dá)減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.20，P<0.05)；而B(niǎo)組和C組的p62表達(dá)增加，以C組明顯，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.12，P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 心肌組織自噬活性標(biāo)志蛋白(LC3和p62)表達(dá)的變化

3 討論

本研究結(jié)果顯示心肌自噬活性改變?cè)陔p腎動(dòng)脈去神經(jīng)治療高血壓心肌肥厚起到重要作用，其中以聯(lián)用氨氯地平治療時(shí)其效果更明顯。既往實(shí)驗(yàn)[6]表明，12周齡SHR呈現(xiàn)心肌肥厚改變。為此，本研究以12周齡SHR為心肌肥厚的研究對(duì)象，探討心肌自噬在腎去神經(jīng)及聯(lián)合氨氯地平治療高血壓大鼠心肌肥厚中的作用。

壓力負(fù)荷是致心肌肥厚的重要誘因，心肌肥厚的病理表現(xiàn)為心室壁變厚、心肌重量增加、心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化、肥厚基因表達(dá)增加。心肌肥厚的持續(xù)加劇，會(huì)導(dǎo)致患者不良預(yù)后，如心源性猝死和心力衰竭[10]。為此，左室肥厚作為心力衰竭的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[11]。目前，本研究12周齡SHR的心肌增厚，肥厚基因表達(dá)增加，心肌病理切片顯示肥厚改變，這與既往壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的結(jié)果一致。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示通過(guò)對(duì)高血壓心肌肥厚的大鼠施行雙側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)治療或聯(lián)合苯磺酸氨氯地平治療均能改善心肌肥厚的相關(guān)指標(biāo)，其中以后者更顯著。

生理水平的自噬反應(yīng)是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的過(guò)程。然而，自噬過(guò)度或不足均會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。既往研究[12]表明，壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，存在自噬的過(guò)度激活；自噬的過(guò)度激活是壓力負(fù)荷心肌肥厚的主要參與者[13]。先前的研究[14]證實(shí)，LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)和p62是聯(lián)合評(píng)價(jià)體內(nèi)自噬活性的標(biāo)志蛋白，當(dāng)體內(nèi)自噬活性增加時(shí)，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)；當(dāng)體內(nèi)自噬活性受抑制時(shí)，其表達(dá)側(cè)相反。目前本研究SHR誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的實(shí)驗(yàn)中，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)上調(diào)，而p62表達(dá)下調(diào)；經(jīng)腎去神經(jīng)治療后，其兩者的表達(dá)相反，其中以聯(lián)合氨氯地平治療組更明顯。這些結(jié)果表明，心肌自噬活性的改變?cè)陔p側(cè)腎動(dòng)脈去神經(jīng)或聯(lián)合氨氯地平抑制心肌肥厚中起到重要作用。

綜上所述，筆者猜測(cè)腎去神經(jīng)聯(lián)合氨氯地平抑制高血壓性心肌肥厚，其作用可能與心肌自噬活性改變相關(guān)。