劉曉黎，王昌明，蔣 明，莫碧文

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，特征是持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限，原因是氣道和肺泡異常，通常與顯著暴露于毒性顆粒和氣體有關(guān)[1]，可通過積極預(yù)防和治療改善其疾病進程。COPD發(fā)病機制并未完全明確，包括：異常炎癥反應(yīng)、氧化/抗氧化失衡、蛋白/抗蛋白酶失衡等，其中炎癥機制尤為重要。氣道、肺實質(zhì)以及肺血管的炎癥是COPD的主要病理特征，級聯(lián)持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管及氣道重構(gòu)，肺血管重構(gòu)是COPD及肺動脈高壓的重要病理基礎(chǔ)。研究[2]表明在COPD早期的異常炎癥反應(yīng)中致炎因素、炎癥過程及炎癥介質(zhì)已經(jīng)開始參與肺動脈重構(gòu)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一種調(diào)控基因表達的DNA結(jié)合蛋白，生物活性廣泛，多項研究證實NF-κB與COPD氣道炎癥、肺血管重構(gòu)[3]密切相關(guān)。實驗通過建立慢支、COPD、COPD并肺動脈高壓動物模型，以NF-κB 特異性抑制劑吡喀烷二硫代氨基甲酸藍(PDTC)作為工具藥，觀測NF-κB表達水平與COPD肺血管重構(gòu)的關(guān)系，探討PDTC在COPD疾病進展中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料雄性健康SPF級SD大鼠48只，體質(zhì)量(200 ±20) g，由桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級清潔實驗室；脂多糖(LPS)、PDTC(美國Sigma公司)；黃果樹牌烤煙型香煙(貴州中煙工業(yè)公司)；醫(yī)用氮氣、無水氯化鈣及鈉石灰；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄Primescript RT reagent kit試劑盒、PCR SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(寶生物工程大連有限公司)；瓊脂糖(美國Gene Tech公司)；NF-κB p65單克隆抗體、羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司)；發(fā)光試劑盒(美國Thermo scientific公司)；自制有機玻璃艙，BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；OX-100A數(shù)字測氧儀(浙江南加分析儀器廠)；TKR-400H電腦小動物呼吸機(南昌新長征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)；IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；T Personal 48基因擴增儀(德國Biometra公司)；Western blot凝膠電泳模具(美國Bio Rad公司)；Image-pro-plus6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)。

1.2動物模型建立與分組隨機將48只SD大鼠分為8組，實驗組及PDTC藥物干預(yù)組各4組，每組6只。制備動物模型，方法如下：實驗組：① 正常對照組：正常飼養(yǎng)28 d后檢測；② 慢支組：第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入LPS 200 μg/次，28 d后檢測；③ COPD組：按照慢支組方法氣道內(nèi)注射LPS，同時每日香煙煙霧暴露1 h/d，共28 d；④ COPD并肺動脈高壓組：按照COPD組方法，實驗共42 d，最后14 d在香煙煙霧暴露的同時，給予18%低氧8 h/d。PDTC藥物干預(yù)組:① 其中慢支干預(yù)組、COPD干預(yù)組、COPD并肺動脈高壓干預(yù)組分別與其相對應(yīng)的實驗組模型制作方法相同，從第15天起予腹腔內(nèi)注射PDTC，劑量為100 mg/(kg·d)；② PDTC藥物干預(yù)空白對照組從第15天起予腹腔內(nèi)注射與PDTC相等劑量的生理鹽水。

1.3驗證實驗動物模型測定氣道阻力、右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)、平均肺動脈壓力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及觀察肺組織病理改變，物模型制備完成第2天用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，調(diào)節(jié)小動物呼吸機，壓力設(shè)定為6 kPa，通過頸部氣管插管將大鼠連接于小動物呼吸機，利用壓力傳感器記錄其氣道阻力。后消毒暴露大鼠胸腔，采用肺動脈插管法，將連有壓力換能器的導(dǎo)管插入肺動脈中，生物機能實驗系統(tǒng)通過壓力傳感器記錄肺動脈壓力曲線、RVSP、mPAP。分離大鼠右肺中葉，浸入多聚甲醛固定24 h，距肺門2～3 mm處取材、切片，行HE染色和VG+維多利亞藍染色，觀察肺組織炎癥浸潤情況。

1.4評價肺血管重構(gòu)指標(biāo)肺組織切片行維多利亞藍+VG染色，采用倒置熒光顯微鏡及 Image-pro-plus6.0圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)測量及分析。觀察肺血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)：每例大鼠隨意取5個視野，200倍鏡下記錄直徑<100 μm的肺腺泡內(nèi)動脈數(shù)量并進行分類,計算三型動脈構(gòu)成比，即肌性動脈(muscular artery,MA)、部分肌性動脈(partially muscular artery,PMA)和非肌性動脈(nonmuscular artery,NMA)。400高倍鏡下計算50 μm<直徑<100 μm肌性動脈的管壁厚度與血管外徑比( the ratio of vascular wall over external diameter,WT%)、管壁面積與血管總面積比(the ratio of vascular wall area over total area,WA%)。右心室肥厚指標(biāo)：大鼠心臟放血后取出，剪除多余組織，分離右心室游離壁、左心室+室間隔，濾紙反復(fù)吸干后稱重，計算右心室肥厚指數(shù)(the ratio of the weight of right ventricle/left ventricle and septum，RV/LV+S)值。

1.5檢測肺組織內(nèi)NF-κBmRNA、蛋白含量用RT-PCR半定量法測定mRNA含量，制備肺組織勻漿，加入TRIzol，提取總RNA，經(jīng)凝膠電泳鑒定、保存。另取適量RNA測其吸光度值，計算RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 保存?zhèn)溆?。加入引物序列、模板、DEPC水、設(shè)定反應(yīng)條件后，進行NF-κB PCR擴增反應(yīng)，再進行瓊脂糖凝膠電泳。然后用凝膠成像分析系統(tǒng)測定每個目的條帶及看家基因β-actin的光密度值,并計算目的基因與β-actin光密度值的比值。

Western blot法檢測肺組織勻漿中NF-κB的表達，于肺組織勻漿中加入蛋白提取液，按照試劑盒步驟提取總蛋白并測定其濃度進行蛋白定量。經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離至硝酸纖維素濾膜,5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加一抗(1 ∶500稀釋)、室溫孵育1 h、PBST洗膜3次加入二抗(1 ∶1 000稀釋)再孵育、洗膜、利用發(fā)光試劑盒發(fā)光、X線膠片暗室顯影。通過凝膠成像分析系統(tǒng)掃描測定各目的條帶及內(nèi)參GAPDH的光密度值，計算其比值，代表NF-κB蛋白表達的相對含量。

2 結(jié)果

2.1驗證實驗動物模型

2.1.1氣道阻力、mPAP、RVSP比較 與正常對照組比較，慢支組氣道阻力、mPAP、RVSP無明顯變化，COPD組及COPD并肺動脈高壓組氣道阻力、mPAP、RVSP均增高(F=26.329、19.362、13.249，P<0.05)；慢支組、COPD組、COPD并肺動脈高壓組氣道阻力依次增高(P<0.05)；COPD并肺動脈高壓組RVSP比COPD組增高(P<0.05)，但兩組間mPAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PDTC干預(yù)后，COPD干預(yù)組較COPD組、COPD并肺動脈高壓干預(yù)組較COPD肺動脈高壓組mPAP、RVSP明顯下降(t=2.673、3.864、2.712、3.841，P<0.05)。見表1。

2.1.2肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 肺組織切片行HE、VG+維多利亞藍染色染色后觀察，相比正常對照組，慢支組小氣道管壁可見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管纖毛柱狀上皮層見杯狀細(xì)胞增生，管腔內(nèi)炎細(xì)胞聚集及黏液分泌增多，平滑肌層未見增厚或斷裂。COPD組氣道腔內(nèi)炎細(xì)胞聚集及黏液蓄積較慢支組更為明顯，管壁內(nèi)浸潤大量炎癥細(xì)胞，柱狀上皮杯狀細(xì)胞增生明顯，平滑肌層增厚，部分肌層已經(jīng)斷裂，黏膜下及外膜見膠原纖維增生，同時有肺氣腫形成，部分可見肺泡壁斷裂形成肺大泡。VG+維多利亞藍染色可見紅染的膠原沉積多于正常對照組。COPD并肺動脈高壓組病理組織學(xué)改變與COPD組相似，但氣道管腔內(nèi)及管壁炎癥細(xì)胞浸潤程度稍輕，平滑肌層增厚更為明顯。經(jīng)PDTC干預(yù)后， COPD干預(yù)組氣道管壁炎癥細(xì)胞浸潤較COPD組減輕。COPD并肺動脈高壓干預(yù)組炎癥浸潤，氣道平滑肌層斷裂、肺泡壁斷裂程度較COPD并肺動脈高壓組減輕。見圖1、2。

2.2動脈構(gòu)成比、肌性動脈WT%和WA%、RV/LV+S比較相比正常對照組，慢支組肺血管重構(gòu)指標(biāo)無明顯改變，COPD組肌化型動脈百分比升高(F=2.663，P<0.05)，對直徑在50～100 μm的肌化型動脈進行圖像分析WA%、WT%比值無升高(F=22.53、28.856，P>0.05)；COPD并肺動脈高壓組肌化型動脈百分比升高，WA%、WT%比值亦升高(P<0.05)。相比各實驗組，COPD干預(yù)組、COPD并肺動脈高壓干預(yù)組肌化型動脈百分比下降(t=5.285、8.179，P<0.05)。COPD并肺動脈高壓干預(yù)組較COPD并肺動脈高壓組WA%、WT%比值亦有所下降(t=2.852、3.65，P<0.05)。見表2、圖2。 相比正常對照組，慢支組RV/LV+S無變化；COPD組、COPD并肺動脈高壓組RV/LV+S值增高(F=3.995，P<0.05)，上述兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PDTC干預(yù)后，COPD并肺動脈高壓干預(yù)組RV/LV+S較COPD并肺動脈高壓組降低(t=2.663，P<0.05)。見表2。

表1 各組氣道阻力、RVSP、mPAP比較

與對應(yīng)實驗組比較：*P<0.05；與正常對照組比較：#P<0.05

圖1 肺組織病理學(xué)變化 HE×20

A：正常對照組；B：慢支組；C：COPD組；D：COPD并肺動脈高壓組；E：干預(yù)空白對照組；F：慢支干預(yù)組；G：COPD干預(yù)組；H：COPD并肺動脈高壓干預(yù)組

圖2 肺小動脈結(jié)構(gòu)變化 VG+維多利亞藍×20

A：正常對照組；B：慢支組；C：COPD組；D：COPD并肺動脈高壓組；E：干預(yù)空白對照組；F：慢支干預(yù)組；G：COPD干預(yù)組；H：COPD并肺動脈高壓干預(yù)組

表2 肺血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)、RV/LV+S分析

與對應(yīng)實驗組比較：*P<0.05；與正常對照組比較：#P<0.05；與COPD并肺動脈高壓組比較：▽P<0.05

圖3 肺組織NF-κB mRNA RT-PCR電泳圖

M：Marker; A：正常對照組；B：慢支組；C：COPD組；D：COPD并肺動脈高壓組；E：慢支干預(yù)組；F：COPD干預(yù)組；G：COPD并肺動脈高壓干預(yù)組

2.3大鼠肺組織內(nèi)NF-κBmRNA含量及蛋白含量

2.3.1肺組織NF-κB mRNA相對含量 相比正常對照組(0.187±0.054)，慢支組(0.240±0.054)NF-κB mRNA表達無明顯變化(t=-1.739，P>0.05)，COPD組(0.331±0.048)較正常對照組(0.153±0.061)、COPD并肺動脈高壓組(0.392±0.068較正常對照組(0.144±0.060)NF-κB mRNA表達顯著增強(t=-5.613、-6.633，P<0.05)；同時COPD并肺動脈高壓組(0.646±0.075)NF-κB mRNA表達明顯強于COPD組(0.541±0.058)(F=70.779，P<0.05)。COPD干預(yù)組(0.243±0.051)較COPD組(0.331±0.048)、COPD并肺動脈高壓干預(yù)組(0.288±0.069)較COPD并肺動脈高壓組(0.392±0.068)NF-κB mRNA表達明顯減弱(t=3.025、3.037，P<0.05)。見圖3。

2.3.2肺組織NF-κB蛋白相對含量 相比正常對照組(0.832±0.202)，慢支組(0.822±0.208)NF-κB蛋白含量無顯著變化，COPD組(1.657±0.230)較正常對照組(0.511±0.116)、COPD并肺動脈高壓組(1.697±0.233)較正常對照組(0.517±0.118)NF-κB蛋白表達增強(t=-10.898、-11.062，P<0.05)。慢支組(0.376±0.117)、COPD組(0.801±0.177)、COPD并肺動脈高壓組(1.550±0.203)NF-κB蛋白表達水平依次遞增(F=73.857，P<0.05)。COPD干預(yù)組(0.874±0.147)、COPD并肺動脈高壓干預(yù)組(0.895±0.190)NF-κB蛋白表達均較其實驗組(1.657±0.230)、(1.697±0.233)減弱(t=17.795、5.949，P<0.05)。見圖4。

3 討論

感染、吸煙是COPD的兩大主要致病因素。研究[4]顯示慢性炎癥、低氧因素與COPD的肺血管重構(gòu)密切相關(guān)，最終導(dǎo)致肺動脈高壓、慢性肺源性心臟病。本實驗制備COPD各階段動物模型，結(jié)果顯示慢支組無氣道阻力增高，病理切片見氣道纖毛倒伏、黏連，杯狀細(xì)胞增生，氣管腔內(nèi)炎細(xì)胞聚集和分泌物增多；COPD組氣道阻力增高，管腔內(nèi)炎細(xì)胞聚集及黏液蓄積，管壁內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，柱狀上皮杯狀細(xì)胞增生明顯，平滑肌層增厚，黏膜下及外膜膠原纖維增生，部分肌層斷裂，肺氣腫形成，部分肺泡壁斷裂形成肺大泡，mPAP、RVSP升高，RV/LV+S、肌化型動脈百分比增高；COPD并肺動脈高壓組病理改變與COPD組相似，但氣道管腔內(nèi)及管壁炎癥浸潤程度稍輕，平滑肌層增厚更明顯。上述模型病理學(xué)改變均與人類慢支、COPD的病理特征吻合，COPD組與COPD并肺動脈高壓組分別代表COPD肺血管重構(gòu)的不同階段，COPD組代表早期階段，表現(xiàn)為肌化型動脈百分比增多；COPD并肺動脈高壓組代表肺血管重構(gòu)進展，腺泡內(nèi)肌化型動脈百分比增高，管壁厚度增加，WA%、WT%比值增高。

NF-κB屬于Rel蛋白家族，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，生物學(xué)功能包括參與炎癥、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖及凋亡、自身的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期的調(diào)控、腫瘤的發(fā)生[5-6]等。NF-κB在氣道炎癥、血管重塑過程中至關(guān)重要[7-8]，是氣道氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物之一，影響IL-1β、iNOS、COX-2、G-CSF、MCP-1等[9]炎癥介質(zhì)基因表達和釋放，并通過反饋環(huán)路導(dǎo)致炎癥過程的放大和持續(xù)。上述炎癥介質(zhì)可影響VFGF、TGF-β、FGF等的調(diào)節(jié)，進一步影響肺血管重構(gòu)。本實驗通過建立COPD相關(guān)動物模型，RT-PCR、Western blot檢測顯示COPD組、COPD并肺動脈高壓組肺組織內(nèi)NF-κB mRNA表達逐漸增強、蛋白含量逐漸增高；且NF-κB mRNA、蛋白的表達與肺血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)變化一致。提示NF-κB表達與大鼠COPD疾病的發(fā)展關(guān)系密切。

PDTC是一種新型抗氧化劑，為NF-κB特異性抑制劑，主要通過泛素化蛋白酶降解途徑影響NF-κB的核移位來抑制其活性[10-11]，PDTC能有效阻斷NF-κB下游低氧誘導(dǎo)因子的激活，延緩COPD疾病的進展。章忠渭 等[12]發(fā)現(xiàn)PDTC能抑制重癥急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB活化。Kan et al[13]等研究表明PDTC 可影響NF-κB、Fas、TNF-α等因子的活性，改善肺損傷。本實驗借助PDTC為工具藥，檢測PDTC藥物干預(yù)組NF-κB mRNA表達及蛋白含量均較對應(yīng)實驗組減少、減弱，RVSP、mPAP值降低，COPD并肺動脈高壓干預(yù)組RV/LV+S值降低，肌化型動脈WT%、WA%比值下降，提示肺血管重構(gòu)得到不同程度的改善。

綜上所述，NF-κB的表達與大鼠COPD疾病的發(fā)展關(guān)系密切，在肺血管重構(gòu)中有相當(dāng)重要的作用，早期利用PDTC干預(yù)NF-κB表達可抑制COPD肺血管重構(gòu)。與COPD階段不同的是，在慢支模型組中未檢測到肺組織NF-κB異常表達，究其原因，可能與檢測時間為第二次氣道內(nèi)注入脂多糖2周之后，以及機體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。NF-κB在COPD發(fā)病過程中有不可忽視的作用，NF-κB抑制劑PDTC可在一定程度上抑制COPD肺血管重構(gòu)，延緩COPD疾病的進程，其聯(lián)系有可能成為COPD疾病新型抗炎類藥物的作用靶點，為臨床治療開拓新方向，但其具體機制仍有待進一步研究及探討。

圖4 肺組織NF-κB Western blot電泳圖

A：正常對照組；B：慢支組；C：COPD組；D：COPD并肺動脈高壓組；E：慢支干預(yù)組；F：COPD干預(yù)組；G：COPD并肺動脈高壓干預(yù)組