周 潔，朱友明，鄒多宏

非編碼RNA(noncoding RNA)是人類基因中不編碼蛋白質(zhì)的RNA，是人類基因轉(zhuǎn)錄過程中不可缺少的一部分，主要包括短鏈、中鏈、長鏈非編碼RNA[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指長度大于200 nt的非編碼蛋白，是非編碼RNA的重要組成部分，由于其特定的位置及功能，近年來越來越多的實驗證明可以運(yùn)用lncRNA作為腫瘤的生物標(biāo)志物和治療的靶向[2]。p53是一種重要的抑癌基因，自1979年被首次報道以來，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示，且有研究[3]顯示lncRNA的一部分與p53基因通路相一致，這暗示著lncRNA與p53基因在細(xì)胞水平上存在聯(lián)系。鑒于此，本課題組運(yùn)用基因芯片技術(shù)篩選了一個表達(dá)受p53正調(diào)控的新lncRNA(ENST00000437008)，命名為lncRNAp53urlnc(p53 upregulated lncRNA)，作為研究對象。該研究主要是為了驗證p53和lncRNAp53urlnc之間的關(guān)系，探討其對舌鱗癌細(xì)胞的影響，希望為臨床應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞人舌鱗癌細(xì)胞系SCC3、人胚胎腎細(xì)胞系293T、大腸桿菌DH5α均由安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)實驗室提供和保存。

1.2主要試劑和儀器高糖DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)；PBS緩沖液(美國Solarbio公司)；胰蛋白酶、嘌呤霉素四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑(美國Sigma公司)；慢病毒包裝試劑(上海和元技術(shù)有限公司)；蛋白定量試劑盒、CO2恒溫孵箱(美國Thermo公司)；shlncRNAp53urlnc質(zhì)粒、shctrl質(zhì)粒、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；actin抗體、p53抗體(美國Santa Cruz公司)；山羊抗兔二抗 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑(日本TaKaRa公司)；DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(美國Axygen公司)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Stratagene 公司)；落地恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SCC3和293T細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖融合達(dá)培養(yǎng)皿80%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1×104/cm2密度傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的SCC3和293T細(xì)胞用于本研究。

1.3.2藥物處理 為了尋找到新的受p53調(diào)控的lncRNA，本課題組對含有p53誘導(dǎo)上調(diào)系統(tǒng)的H1299細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析(H1299細(xì)胞以及相應(yīng)的基因芯片分析由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬實驗室完成與提供)，發(fā)現(xiàn)了大量的受p53誘導(dǎo)上調(diào)和下調(diào)的lncRNA。本課題組對其中上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)較高的lncRNA進(jìn)行了驗證，其中一條lncRNA(ENST00000437008)上調(diào)變化倍數(shù)較明顯，本課題組將其命名為lncRNAp53urlnc(p53 upregulated lncRNA)，lncRNAp53urlnc是一個位于3號染色體長度為838 bp的長片段非編碼RNA，lncRNAp53urlnc共含有5個外顯子。收集生長狀態(tài)良好的對數(shù)期H1299細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以1×106個/孔細(xì)胞數(shù)接種到6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。次日，使用含1 μg/ml鹽酸阿霉素的PBS處理H1299細(xì)胞，分別于0、6、12 h收集相應(yīng)時間點(diǎn)獲取H1299細(xì)胞的RNA和蛋白，使用Western blot法檢測細(xì)胞中p53的表達(dá)，使用qRT-PCR檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)。

1.3.3重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建 本實驗主要使用polk.1和flag質(zhì)粒載體構(gòu)建6個質(zhì)粒載體，具體分為以下3組：① plko.1-shp53及plko.1-shp53-ctrl(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬實驗室獲取)；② flag-p53及flag空載體(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬實驗室獲取)；③plko.1-shlncRNAp53urlnc及plko.1-shlncRNAp53urlnc-ctrl。載體引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計和合成。Sh-lncRNAp53urlnc-1與Sh-lncRNAp53urlnc-2序列如下: Sh-lncRNAp53urlnc-1:5′-CCGGTATGGGAGGTCTCTGAGATCTCGAGATCTC AGAGACCTCCCATATTTTTG-3′；Sh-lncRNAp53urlnc-2:5′-AATTCAAAAATATGGGAGGTCTCTGAGATCTG AGATCTCAGAGACCTCCCATA-3′。

1.3.4慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染SCC3

1.3.4.1慢病毒包裝 收集對數(shù)期生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，選擇合適的密度接種于6孔板上，帶細(xì)胞增殖融合至培養(yǎng)皿50%時，分別取攜帶上述目的基因片段的載體(2 μg)和病毒包裝質(zhì)粒(2 μg pGag、2 μg pRev、1 μg pVsvg)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集上清液，0.45 μm PVDF濾器過濾，分裝，-80 ℃冰箱儲存。

1.3.4.2慢病毒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，收集對數(shù)期生長狀態(tài)良好的SCC3細(xì)胞，選擇合適的密度接種于6孔板上，帶細(xì)胞增殖融合至培養(yǎng)皿30%時，加入各病毒液以及2 μl的8 μg/ml polybrene,孵育4 h后加入嘌呤霉素篩選1～2周。

1.3.5qRT-PCR檢測 慢病毒轉(zhuǎn)染后，分別提取轉(zhuǎn)染后各組SCC3細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行qRT-PCR定量檢測各組lncRNA的表達(dá)水平。使用TRIzol提取試劑盒，按操作指南，分別提取各組細(xì)胞的總RNA。采用PrimeScriptTMRT-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成相應(yīng)cDNA 。qRT-PCR檢測lncRNAp53urlnc和actin基因的相對表達(dá)量，實時定量儀檢測。所有測定進(jìn)行3次重復(fù)。所有PCR引物由上海生工生物工程公司進(jìn)行設(shè)計，引物序列見表1。

表1 基因擴(kuò)增引物序列表

1.3.6Western blot檢測 慢病毒轉(zhuǎn)染后，分別于第3天收集細(xì)胞，PBS液離心漂洗細(xì)胞3次。使用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測定各樣本蛋白的濃度，選擇12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。根據(jù)蛋白分子量的大小選擇電泳時間，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂蛋白在室溫下封閉2 h后，將膜在p53和actin特異性一抗中4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗3次。發(fā)光檢測儀曝光后收集相應(yīng)發(fā)光信號，分析各組p53相對表達(dá)量。所有測定進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.7MTT法檢測 選擇對數(shù)生長期狀態(tài)良好的SCC3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染shlncRNAp53urlnc和shctrl后，按2×103個/孔均勻接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入200 μl的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)0、6、12、24、48、72 h后，加入MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，避光低速震蕩10 min。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，繪制各組細(xì)胞生長曲線。所有測定進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.8集落形成實驗檢測 選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期shlncRNAp53urlnc和shctrl組的SCC3細(xì)胞，常規(guī)消化傳代，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，以3×102個/孔接種于6孔板中，每孔加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)14 d。吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min后使用1%結(jié)晶紫染液染色4 h，清洗晾干，肉眼觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1p53上調(diào)lncRNAp53urlnc表達(dá)阿霉素處理H1299細(xì)胞后，分別獲取H1299細(xì)胞的RNA和蛋白，使用Western blot法檢測細(xì)胞中p53的表達(dá)，使用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)。經(jīng)過0、6、12 h梯度時間點(diǎn)顯示，p53和lncRNAp53urlnc的表達(dá)均隨著時間而增大，與芯片結(jié)果一致。見圖1。

圖1 阿霉素處理H1299細(xì)胞后p53和lncRNAp53urlnc的變化

A：加入阿霉素后p53的表達(dá)情況；B：加入阿霉素后lncRNAp53urlnc的表達(dá)情況

2.2敲低和過表達(dá)p53對SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc表達(dá)的影響為了研究lncRNAp53urlnc與口腔癌的關(guān)系，本課題組包裝shctrl和shp53病毒，并分別感染SCC3細(xì)胞，使用Western blot法檢測細(xì)胞中p53的表達(dá)，qRT-PCR法檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)。結(jié)果顯示，shp53組p53表達(dá)明顯低于shctrl組，同時shp53組lncRNAp53urlnc的表達(dá)也明顯低于shctrl組(shp53組: 0.283±0.419，shctrl組:1.030±0.638，F(xiàn)=217.558,P=0.001)，見圖2 ；flag空載體和flag-p53轉(zhuǎn)染SCC3細(xì)胞后，使用Western blot法檢測細(xì)胞中p53的表達(dá)，qRT-PCR法檢測細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)，結(jié)果顯示：flag-p53組p53表達(dá)水平明顯高于flag組，同時flag-p53組lncRNAp53urlnc的表達(dá)水平也明顯高于flag組(flag-p53組：4.725±0.188, flag組：1.021±0.970,F=851.028,P<0.001)，見圖3。以上結(jié)果表明：lncRNAp53urlnc的表達(dá)與p53呈正相關(guān)性。

圖2 敲低p53表達(dá)對SCC3細(xì)胞中SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc表達(dá)的影響

A：shctrl組和shp53組p53蛋白的表達(dá)；B：shctrl組和shp53組lncRNAp53urlnc的表達(dá)；與shctrl組比較：**P<0.01

圖3 過表達(dá)p53對SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc表達(dá)的影響

A：flag組和flag-p53 組p53蛋白的表達(dá)；B：flag組和flag-p53 組lncRNAp53urlnc的表達(dá)；與flag組比較：***P<0.001

2.3shlncRNAp53urlnc干擾lncRNAp53urlnc的表達(dá)使用qRT-PCR法檢測shlncRNAp53urlnc組和shctrl組中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)水平，結(jié)果顯示shlncRNAp53urlnc組lncRNAp53urlnc的水平明顯低于shctrl組(F=191.201,P<0.05)。這表明shlncRNAp53urlnc成功下調(diào)lncRNAp53urlnc的表達(dá)。見圖4。

2.4shlncRNAp53urlnc對SCC3細(xì)胞生長的影響MTT細(xì)胞增殖實驗檢測感染shlncRNAp53urlnc病毒后SCC3細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示shlncRNAp53urlnc組細(xì)胞增殖速度明顯高于shctrl組。采用集落形成實驗來檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細(xì)胞集落形成能力，經(jīng)過14 d顯示：shlncRNAp53urlnc組細(xì)胞形成的集落數(shù)量明顯高于shctrl組(F=111.722,P<0.05)。結(jié)果表明：敲低SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖生長。見圖5、6。

圖4 轉(zhuǎn)染shlncRNAp53urlnc目的基因后對SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNAp53urlnc表達(dá)的影響

圖5 MTT法檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細(xì)胞數(shù)量的變化

圖6 集落形成實驗檢測shlncRNAp53urlnc組SCC3細(xì)胞集落情況與shctrl組比較：*P<0.05

3 討論

p53作為重要的腫瘤抑制基因，可能通過抑制與DNA復(fù)制相關(guān)的細(xì)胞基因或基因產(chǎn)物而發(fā)揮作用，包括阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定、抑制腫瘤血管生成等。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究[3]表明, lncRNA 在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，其表達(dá)或功能異常與癌癥、退行性神經(jīng)疾病等關(guān)系密切, 具體表現(xiàn)在序列和空間結(jié)構(gòu)上的異常、表達(dá)水平的異常、與結(jié)合蛋白相互作用的異常等。研究[3]顯示lncRNA和p53信號通路存在顯著的相關(guān)性。

p53的反應(yīng)過程是一個快速的活化過程，并且對細(xì)胞存亡有著精密的調(diào)控機(jī)制，受多種因素調(diào)控，例如蛋白質(zhì)和RNA等。p53蛋白的翻譯后調(diào)控是控制p53活化結(jié)果的一個重要因素[4-6]。調(diào)控p53的一個關(guān)鍵因素就是MDM2蛋白，可以通過泛素蛋白酶體途徑結(jié)合p53來控制自身的穩(wěn)定性[7-8]。這樣的磷酸化結(jié)果可以通過抑制p53泛素化來維持p53的穩(wěn)定，并且特定殘基的磷酸化也許是調(diào)節(jié)p53激活的一條重要途徑[9-10]。除了蛋白質(zhì)，其他類型的調(diào)控分子也可以參與p53的調(diào)控，例如microRNA[7]。目前多種腫瘤研究表明，功能性長鏈非編碼RNA與p53存在著密切聯(lián)系。

長鏈非編碼RNA主要存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的一類RNA，通過將染色質(zhì)復(fù)合物調(diào)節(jié)到合適的目的基因序列中來實現(xiàn)可調(diào)節(jié)的特異性[10]。lncRNA可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，部分lncRNA可以與基因沉默有關(guān)的染色質(zhì)修飾物結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制，如Polycomb組(PCG)蛋白、組蛋白H3賴氨酸9(H3K9甲基化，組蛋白賴氨酸甲基化酶)等；另一方面，部分lncRNA可以通過與表觀遺傳活化因子的相互作用來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活，如H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1復(fù)合物[11]。lncRNA-p21是最早發(fā)現(xiàn)的影響p53轉(zhuǎn)錄的核心組件之一，研究[12]顯示lncRNA下調(diào)和抑制p53所產(chǎn)生的基因庫存在大部分的重疊，這也就說明lncRNA-p21是抑制p53表達(dá)的主要RNA，此類RNA主要抑制核糖核蛋白K(hnRNP K),這類蛋白是在p53信號通路中作為阻遏基因，與相關(guān)基因結(jié)合從而抑制p53的合成。lncRNA以往一直作為癌基因或抑癌基因來研究，但近年來越來越多的實驗[3]證明lncRNA和p53信號通路存在顯著的相關(guān)性。大量研究[13]已證實p53可以誘導(dǎo)促進(jìn)lncRNA的生成，而lncRNA也可以通過結(jié)合特殊位點(diǎn)影響染色質(zhì)的構(gòu)象來促進(jìn)p53是表達(dá)，lncRNA與p53的相互作用可以進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

舌鱗癌是口腔鱗狀細(xì)胞癌中最常見的一種腫瘤，鑒于p53和lncRNA對腫瘤特殊作用，本課題組進(jìn)行了本研究并加以驗證。實驗表明：細(xì)胞在用阿霉素誘導(dǎo)后，p53表達(dá)逐漸上調(diào)，同時伴隨著lncRNAp53urlnc的上調(diào)。構(gòu)建重組基因載體，分別敲低和過表達(dá)SCC3細(xì)胞中的p53基因，結(jié)果顯示，敲低p53表達(dá)時，lncRNAp53urlnc水平下調(diào)；過表達(dá)p53基因時，lncRNAp53urlnc水平上調(diào)，證實lncRNAp53urlnc與p53水平呈正相關(guān)性。進(jìn)一步實驗顯示敲低lncRNAp53urlnc可以SCC3促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，可以得出結(jié)論，p53通過正調(diào)控lncRNAp53urlnc來抑制SCC3細(xì)胞的增殖。但lncRNAp53urlnc是如何受p53基因調(diào)控的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。