劉珂欣，辛寒曉，范學(xué)明，劉麗英，孫中濤

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2. 山東佐田氏生物科技有限公司，山東 濟南 250000)

我國是水稻種植大國，近年來水稻病害的發(fā)生嚴重影響了我國的水稻生產(chǎn)業(yè)[1]，其中，水稻惡苗病是最為嚴重的病害之一。水稻惡苗病是一種種傳真菌性病害，發(fā)病面積廣，造成的經(jīng)濟損失巨大，已成為影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[2]?；瘜W(xué)藥劑浸泡稻種是防治水稻惡苗病的有效措施[3]，但長期使用化學(xué)藥劑不僅導(dǎo)致水稻惡苗病菌產(chǎn)生抗藥性，而且污染土壤和環(huán)境，危害人類健康，因此，高效、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥逐步代替高毒化學(xué)農(nóng)藥已成為必然趨勢[4]。分離對水稻惡苗病菌具有拮抗作用的微生物并用于制備生防菌劑已成為研究熱點。產(chǎn)祝龍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉對水稻惡苗病菌具有較強的拮抗作用。張淑梅等[6]從番茄葉中分離篩選出一株多粘類芽孢桿菌SD-6，對水稻惡苗病具有一定的防治作用。尚慧等[7]從云南省土壤中分離到一株放線菌(Actinomyces)YIM34165，可用于水稻惡苗病的防治。多粘類芽孢桿菌因能產(chǎn)生芽孢，抗逆性強，菌劑的生物穩(wěn)定性高，應(yīng)用效果好，是最具有應(yīng)用價值的生防菌種[8]。但是目前多粘類芽孢桿菌的生產(chǎn)普遍存在菌數(shù)和芽孢生成率較低的問題，李玉洋等[9]對多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，雖然提高了菌數(shù)和芽孢生成率，但其選用菌糠作為主要發(fā)酵原料，存在不同來源的菌糠成分變化大、水分高、不易收集和貯存等問題，不具有普遍適用性。

本研究采用來源廣泛、成分相對穩(wěn)定、易于保存的麩皮為基礎(chǔ)原料，通過對多粘類芽孢桿菌CH-23固態(tài)發(fā)酵工藝的系統(tǒng)優(yōu)化，提高了活菌數(shù)和芽孢生成率，為多粘類芽孢桿菌生防菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 多粘類芽孢桿菌CH-23，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程實驗室篩選并保存。

1.1.2 試劑 玉米粉、麩皮、豆粕粉等，購自泰安市農(nóng)貿(mào)市場；糖蜜，購自濟南領(lǐng)航化工有限公司；蛋白胨、酵母粉，購自天津市英博生化試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面菌種培養(yǎng)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。三角瓶液體菌種培養(yǎng)基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4。固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮100%，料水比1∶1。

1.2 試驗方法

1.2.1 最佳碳、氮源及無機鹽的選擇 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度的玉米粉或15%(w/w)的葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜等碳源，在500 mL的三角瓶中進行固態(tài)發(fā)酵，裝料量為25 g，種子液的接入量為10%(w/w)，33℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h搖瓶一次，48 h發(fā)酵結(jié)束后，測定活菌數(shù)與芽孢生成率，以篩選最佳碳源。在此基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度的蛋白胨、1%(w/w)的酵母粉、豆粕粉或0.5%(w/w)的尿素、硫酸銨進行固態(tài)發(fā)酵，以篩選最佳氮源。碳源與氮源選定后，再分別添加不同濃度的硫酸錳、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸鋅等無機鹽進行固態(tài)發(fā)酵，以優(yōu)化無機鹽的最佳添加量。所有試驗均設(shè)3個平行，重復(fù)2次。

1.2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計 在1.2.1單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用 11因素的 Plackett-Burman 試驗設(shè)計，考察碳源、氮源和無機鹽對CH-23菌株活菌數(shù)與芽孢生成率的影響，以確定其顯著因素，各因素及其水平見表 1。試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析均采用軟件 Design Expert 8.0.6(Stat-Ease Corp., Minneapolis, MN, USA)。

1.2.3 Box-Behnken 試驗設(shè)計 在Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計對影響CH-23菌株活菌數(shù)與芽孢生成率的 3個顯著性因素作進一步優(yōu)化，試驗因素與水平見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗因素和水平

表2 Box-Behnken 試驗因素和水平

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 在培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗設(shè)計，分別在不同初始pH值、初始含水量、接種量和發(fā)酵溫度等條件下進行發(fā)酵試驗，以確定多粘類芽孢桿菌 CH-23的最佳發(fā)酵條件。試驗均設(shè)3個平行，重復(fù)2次。

1.2.5 對水稻惡苗病的防治效果 盆栽試驗在盆口內(nèi)徑、盆底內(nèi)徑和盆高分別為30、25 cm和30 cm的陶盆中進行。盆栽用土的全氮、全磷、全鉀含量分別為1.07、2.31、5.57 g/kg，pH 6.52，電導(dǎo)率0.313 S/m。試驗設(shè)4個處理，如表3所示，每個處理設(shè)3組平行，每組10盆，共120盆。每盆移栽長勢均一的水稻秧苗5棵。試驗所用多粘類芽孢桿菌CH-23菌劑為麩皮培養(yǎng)物，含菌量為2 × 1010cfu/g，水稻秧苗移栽前，將菌劑與盆栽土混合均勻。水稻惡苗病孢子懸液的濃度為1×107cfu/mL，其施入方式為秧苗移栽后噴施。多菌靈懸濁液為50%多菌靈可濕性粉劑的800倍稀釋液，在水稻惡苗病孢子懸液噴施2天后進行噴施。按常規(guī)方式進行栽培管理，觀察記錄發(fā)病株數(shù)和相對病斑高度，并計算病級、病情指數(shù)和防治效果。病害分級標準見參考文獻[10]，病級、病情指數(shù)及相對防效按下述公式計算[10]：

病級=(病斑高度/植株高度)× 9級；

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病水稻數(shù) × 相應(yīng)病情級別數(shù))/(水稻總株數(shù) × 最高病情級別數(shù))× 100；

相對防效(%)=(CK2的病情指數(shù) - CH-23處理的病情指數(shù))/CK2的病情指數(shù) × 100。

表3 盆栽試驗設(shè)計

1.2.6 活菌數(shù)與芽孢率的測定 活菌數(shù)：采用平板菌落計數(shù)法[11]進行測定；芽孢率：80℃水浴15 min，殺死未產(chǎn)芽孢的細菌，然后采用平板菌落計數(shù)法測定芽孢數(shù)，并計算芽孢率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳、氮源以及無機鹽對多粘類芽孢桿菌CH-23菌體生長與產(chǎn)孢率的影響

如表4所示，向麩皮培養(yǎng)基中補充5 種碳源均可提高活菌數(shù)和芽孢生成率，其中以添加15%玉米粉效果最佳，活菌數(shù)和芽孢生成率分別比對照提高了53.37%和26.38%。此結(jié)果與胡飛等[12]的研究結(jié)果一致，但在陸璇等[13]的研究中糯米粉是最佳附加碳源，這可能因為采用的菌株不同，其生理特性存在差異。補充5 種氮源均可提高CH-23 菌株的活菌數(shù)和芽孢生成率，且以1.5%的蛋白胨效果最好，與對照相比，活菌數(shù)和芽孢生成率分別提高68.75%和26.38%，此結(jié)果與俞坤輝[14]的研究結(jié)果相似，但在牛夢天[15]的研究中豆餅粉是最佳氮源，說明不同生產(chǎn)菌株，其最適氮源也存在差異。

表4 碳源與氮源對多粘類芽孢桿菌菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

注：同列數(shù)據(jù)中，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

如表5所示，添加無機鹽對菌體生長和芽孢形成影響較大。與未添加無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基(對照)相比，添加硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、磷酸氫二鉀均可促進菌體和芽孢生長，尤其是硫酸錳，當其用量為0.100%時，活菌數(shù)和芽孢率分別增加了21.84%和22.13%。

表5 無機鹽對多粘類芽孢桿菌菌體生長和產(chǎn)孢率的影響

2.2 Plackett-Burman 試驗結(jié)果

Plackett -Burman 試驗結(jié)果如表6所示，采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，可得兩個回歸方程：

R1=3.220+0.350X1+0.012X2+0.058X3-0.110X4+0.360X5+0.520X6+0.200X7+0.032X8-0.440X9+0.010X10+0.060X11；

R2=57.400+6.050X1+2.220X2+1.840X3-0.500X4+2.660X5-0.880X6+3.330X7+0.0310X8-3.950X9+0.490X10+ 0.710X11。

式中：R1為活菌數(shù)(×1010cfu/g)；R2為芽孢生成率(%)；X1～X11為自變量的編碼值。兩個模型均極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.991 4和0.992 8，表明其擬合度和可信度均很高。

表6 Plackett-Burman試驗結(jié)果

模型系數(shù)的方差分析結(jié)果如表7所示。除硫酸鋅(X4)和硫酸銨(X9)對活菌數(shù)和芽孢生成率、硫酸鎂(X6)對芽孢生成率為負效應(yīng)外，其他因素均為正效應(yīng)。其中玉米粉(X1)、硫酸錳(X5)、蛋白胨(X7)對芽孢生成率的影響均達到了極顯著水平(P<0.01)；豆粕粉(X2)和磷酸氫二鉀(X3)對活菌數(shù)的影響不顯著，但對芽孢生成率的影響達到了顯著水平；硫酸鎂(X6)對活菌數(shù)的影響極顯著，但對芽孢生成率的影響不顯著；酵母粉(X8)和尿素(X10)對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響均未到達顯著水平(P>0.05)。因此，從提高活菌數(shù)和芽孢生成率及節(jié)約成本的角度考慮，后續(xù)試驗中，硫酸銨(X9)、豆粕粉(X2)、酵母粉(X8)和尿素(X10)不再添加，其余各因子均取其最優(yōu)水平，即硫酸鋅0.050%、硫酸鎂0.15%、磷酸氫二鉀0.10%，且玉米粉(X1)、硫酸錳(X5)、蛋白胨(X7)將采用響應(yīng)面試驗繼續(xù)優(yōu)化。

表7 Plackett-Burman試驗方差分析結(jié)果

注：“*”表示在95%置信區(qū)間內(nèi)顯著；“**”表示在99%置信區(qū)間內(nèi)顯著。下同。

2.3 Box-Behnken試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表8，利用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，獲得兩個二元多項回歸方程：

式中：R1為活菌數(shù)(×1010cfu/g)；R2為芽孢生成率(%)；X1～X3為自變量的編碼值。

對回歸模型的方差分析結(jié)果如表9所示，兩個回歸模型均極顯著(P<0.01)，失擬項均不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.993 4和0.980 4，表明方程能夠很好地對發(fā)酵過程進行描述及預(yù)測，擬合度和可信度均很高。一次項中，X1對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響均不顯著(P>0.05)，X2均極顯著(P<0.01)，X3均顯著(P<0.05)；交互項中，X1X3對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響均極顯著(P<0.01)，X2X3對活菌數(shù)影響不顯著(P>0.05)，但對芽孢生成率影響顯著(P<0.05)；二次項對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響均極顯著(P<0.01)。

顯著性因素X2和X3對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響如圖1所示，拋物面開口向下，模型存在最大值。設(shè)定活菌數(shù)和芽孢生成率的權(quán)重相同，對回歸方程組求極值，所得最佳點為玉米粉15.20%、蛋白胨1.59%、硫酸錳0.09%，所對應(yīng)的最高活菌數(shù)和芽孢生成率分別為4.53×1010cfu/g和91.73%。為驗證模型預(yù)測結(jié)果的準確性，在上述條件下進行了3次驗證試驗，活菌數(shù)和芽孢生成率的實測值分別為(4.39±0.56)× 1010cfu/g和(89.86±4.08)%，與預(yù)測值接近，說明該模型具有較好的預(yù)測性，所得最佳點有效。

表8 Box-Behnken試驗結(jié)果

表9 Box- Behnken試驗方差分析結(jié)果

2.4 培養(yǎng)條件對CH-23菌株生長與產(chǎn)孢的影響

如表10所示，初始含水量為55%時，活菌數(shù)和芽孢生成率最高，均與初始含水量為50%的處理差異顯著(P<0.05)，與初始含水量60%的處理相比，活菌數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但芽孢生成率差異顯著(P<0.05)。初始pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，CH-23菌株均可大量生長，且在pH 7.5時活菌數(shù)和芽孢生成率最高。CH-23菌株的最適培養(yǎng)溫度為33℃，此時活菌數(shù)和芽孢生成率均最高。隨著接種量的增加(2%～10%)，活菌數(shù)和芽孢生成率均逐漸增大，接種量為10% 時，活菌數(shù)和芽孢生成率達到最高值。

圖1 蛋白胨和硫酸錳對活菌數(shù)和芽孢生成率的影響

2.5 對水稻惡苗病的防治作用

水稻盆栽試驗結(jié)果如表11所示。試驗期間，CK1發(fā)病指數(shù)為零，CK2發(fā)病指數(shù)高達71.23%，說明試驗采用的水稻惡苗病病菌懸液對受試水稻具有較強的致病性。與CK2相比，多粘類芽孢桿菌CH-23菌劑處理的發(fā)病指數(shù)僅為28.55%，平均相對防效高達68.35%，與多菌靈處理相比，防效差異不顯著，說明多粘類芽孢桿菌CH-23菌劑對水稻惡苗病具有良好的防治效果。

表10 培養(yǎng)條件對多粘類芽孢桿菌CH-23生長與產(chǎn)孢的影響

注：同參數(shù)、同列數(shù)據(jù)中，不同字母表差異顯著(P<0.05)。

表11 多粘類芽孢桿菌CH-23對水稻惡苗病的防治效果

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05, Duncan 氏新復(fù)極差法)。

3 討論與結(jié)論

農(nóng)用微生物菌劑的生產(chǎn)有液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種方式，液態(tài)發(fā)酵因具有自動化程度高、發(fā)酵液活菌數(shù)高、芽孢生成率高等優(yōu)勢，成為主要的生產(chǎn)方式。但固態(tài)發(fā)酵也具有液態(tài)發(fā)酵不可比擬的優(yōu)勢，如生產(chǎn)用水少、排污少、能耗低、對原料適應(yīng)性強、設(shè)備投資少等。隨著能源和水資源成本的升高，環(huán)保壓力的增大，固態(tài)發(fā)酵又重新受到重視。本研究以麩皮為基礎(chǔ)原料，采用固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)多粘類芽孢桿菌菌劑，通過對發(fā)酵條件的系統(tǒng)優(yōu)化，活菌數(shù)提高至4.39×1010cfu/g，是液體發(fā)酵平均水平的2倍，芽孢生成率提高至89.86%，達到了液體發(fā)酵的平均水平，具有進行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的可行性。

錳離子對多粘類芽孢桿菌等微生物的生長與芽孢形成具有重要影響。甄靜等[16]。研究表明，添加0.5%的硫酸錳對多粘類芽孢桿菌的生長及芽孢的形成具有極大的促進作用。本研究硫酸錳的最適添加量為0.09%，其原因一方面是菌株差異，另一方面是培養(yǎng)基原料自身的錳離子含量存在差異。初始含水量不僅影響基質(zhì)的水活度，還影響固態(tài)發(fā)酵過程中氧的傳遞和基質(zhì)的膨脹程度等物理性質(zhì)[16]。趙國群等[17]用梨渣和麩皮對多粘類芽孢桿菌進行固態(tài)發(fā)酵，初始含水率58.20%時菌數(shù)和芽孢生產(chǎn)率最高，本研究采用麩皮和玉米粉進行多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵，最適初始含水量為50%，說明培養(yǎng)基組成不同，其吸水和保水能力、疏松程度和透氣情況等存在差異，即便培養(yǎng)同一種微生物，最佳初始含水量也會存在差異。多粘類芽孢桿菌CH-23菌劑對水稻惡苗病具有較好的生防效果，生防指數(shù)高達68.35%。但不同栽培時期相對防效不同，栽培前期防效較好，隨著栽培期的延長防效有所下降。

總之，多粘類芽孢桿菌CH-23可采用來源廣泛、成分相對穩(wěn)定、易于保存的麩皮為基礎(chǔ)原料，補充碳、氮源及無機鹽，以固態(tài)發(fā)酵的方式進行生產(chǎn)，固態(tài)發(fā)酵工藝經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)化后，活菌數(shù)和芽孢生成率大幅提高，達到了工業(yè)化生產(chǎn)要求。多粘類芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菌劑對水稻惡苗病具有較好的防治效果，可用做生防菌劑。