溫智慧，李敬知，馮瑞琪，蘇意德，張愛利*

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

隨著能源不斷短缺和環(huán)境不斷惡化，新型能源的開發(fā)和利用備受矚目。短鏈醇類作為清潔可再生生物能源，是重要的化工原料，也是化石燃料的理想替代者[1]。其中異丁醇吸濕性低，辛烷值高，其能量密度（27 MJ/L）與汽油（32 MJ/L）相近，燃燒產(chǎn)物對環(huán)境無污染[2]，具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)短鏈醇憑借綠色、低能耗和生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢迅速成為生物能源研究的熱點。然而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，代謝產(chǎn)物不斷積累，高濃度的醇類會破壞細(xì)胞膜的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性[3]，影響線粒體的功能[4]，嚴(yán)重抑制發(fā)酵過程，如延長發(fā)酵時間[5]、降低原料轉(zhuǎn)化率和下游產(chǎn)品回收率[6]等，因此，篩選一株異丁醇耐受性高的菌株是提高微生物發(fā)酵產(chǎn)醇的關(guān)鍵。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與其他微生物相比，具有合成異丁醇的天然優(yōu)勢：DICKINSON J R等[7]在2000年就確定了釀酒酵母細(xì)胞可通過L-纈氨酸代謝途徑合成異丁醇，如今其代謝網(wǎng)絡(luò)已被研究的相對透徹，易于基因操作[8]。在2011年，CHEN X等[9]在釀酒酵母中過量表達(dá)編碼乙酰乳酸合酶基因ILV2，厭氧條件下，異丁醇產(chǎn)率達(dá)到了0.97mg/g葡萄糖。在2012年，BRATD等[10]將線粒體中的ILV2、ILV5和ILV3基因定位到細(xì)胞質(zhì)中，同時過量表達(dá)編碼苯丙酮酸脫羧酶的基因ARO10，異丁醇產(chǎn)率達(dá)到15mg/g葡萄糖。此外，釀酒酵母細(xì)胞細(xì)胞壁堅韌，抗逆性強[11]，發(fā)酵底物來源廣泛，可利用自然界中廣泛存在的木質(zhì)纖維素[12]，是實現(xiàn)生物發(fā)酵產(chǎn)醇的首選微生物。

誘變技術(shù)可以彌補一般的基因修飾難以形成生物新性狀的不足，對產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)基因資源有重要意義。甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是一類主要作用于細(xì)胞內(nèi)核酸的烷化劑[13]，具有點突變頻率高、突變專一、染色體畸變相對較少等諸多優(yōu)點[14]。目前，利用EMS誘變技術(shù)已成功構(gòu)建了多種植物的突變體庫，并且成功篩選出了具有優(yōu)良性狀的植物，如玉米、番茄和擬南芥等[15]，而將其應(yīng)用于微生物的研究相對較少。

為了得到異丁醇耐受性良好的菌株，進(jìn)一步提高異丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量，本實驗利用EMS誘變釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A，篩選出數(shù)株突變菌株，通過對比細(xì)胞生長及耗糖情況，得到了一株遺傳穩(wěn)定、異丁醇耐受性良好且發(fā)酵能力相對較強的突變菌株。在上述篩選得到的突變菌株中過量表達(dá)L-纈氨酸代謝途徑中的節(jié)點基因ILV2、ILV5、ILV3和ARO10并對其發(fā)酵性能進(jìn)行檢測，得到一株異丁醇耐受性良好且發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量較高的工程菌株，為進(jìn)一步提高釀酒酵母細(xì)胞生產(chǎn)異丁醇的能力提供了新思路，為實現(xiàn)新型能源異丁醇投入發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A：河北工業(yè)大學(xué)菌種保藏室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲基磺酸乙酯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶（10 U/mL）、T4 DNA連接酶（10 U/mL）：美國Thermo Scientific公司；Taq DNA聚合酶（500 U/mL）：北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母抽提物，20 g/L葡萄糖，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉，pH自然，121℃滅菌20min；

含異丁醇的YPD培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的異丁醇；

完全選擇培養(yǎng)基：6.7g/L無氨基酸酵母氮源（yeastnitrogenbase without amino acids，YNB），20 g/L葡萄糖，2 g/L除去標(biāo)記氨基酸的氨基酸混合物，pH值為5.6，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，pH值為6.5，121℃滅菌20 min。

1.1.4 引物及質(zhì)粒

實驗中所用的質(zhì)粒和引物分別如表1和表2所示。

表1 本研究中所用質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中所用引物序列Table 2 Sequences of primers used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

SHK-99-Ⅱ臺式空氣恒溫?fù)u床：北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Hema3200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；721G紫外可見光分光光度計：上海儀電（集團(tuán)）有限公司；Centrifuge5424高速離心機：上海艾本德生物技術(shù)國際貿(mào)易有限公司；1260型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）：美國Agilent公司；SCION 456-GC氣相色譜儀（gas chromatograph，GC）：布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細(xì)胞活化

將釀酒酵母細(xì)胞接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃空氣浴搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。

1.3.2 平板稀釋法稀釋細(xì)胞

將釀酒酵母W303-1A活化后，取適量菌液于紫外分光光度計下測定其在波長600nm處的OD600nm值。將菌液OD600nm值調(diào)節(jié)為1，依次10倍稀釋菌液稀釋度至101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取10 μL上述不同稀釋度的菌懸液，滴于YPD固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落數(shù)。

1.3.3 W303-1A的異丁醇耐受性

將活化后的細(xì)胞懸液稀釋至合適倍數(shù)，取100 μL分別涂于含異丁醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的YPD固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察細(xì)胞生長情況。

1.3.4 EMS含量的確定

將菌株W303-1A活化后，于13000r/min離心收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液洗滌兩次，離心去上清。用1 mL磷酸緩沖液重懸細(xì)胞后，加入EMS原液，使EMS終質(zhì)量濃度分別為0、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL，70 μg/mL，置于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)30 min。向上述離心管中加入1 mL 5 mg/100 mL的硫代硫酸鈉溶液，繼續(xù)搖床培養(yǎng)10min以解除EMS的毒性。從搖床中取出菌懸液，13 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，按稀釋平板法稀釋至10-3，然后分別取40 μL涂布于含有不同含量異丁醇的YPD固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。觀察菌株生長情況，并計算致死率，其計算公式如下：

1.3.5 突變菌株的篩選

釀酒酵母菌W303-1A經(jīng)EMS誘變后按稀釋平板法稀釋至合適的OD600nm值，涂于含2%異丁醇的YPD固體培養(yǎng)基上，同時涂在不含異丁醇的YPD固體培養(yǎng)基上作對照。觀察細(xì)胞生長情況并計數(shù)，篩選出生長旺盛的菌株重新培養(yǎng)于含3%異丁醇的YPD培養(yǎng)基上再次進(jìn)行耐受性篩選，連續(xù)培養(yǎng)至第8代，驗證遺傳穩(wěn)定性。

1.3.6 重組質(zhì)粒與工程菌的構(gòu)建

以釀酒酵母W303-1A染色體為模板，利用PCR擴增出所需目的基因ILV2、ILV5、ARO10、ILV3，純化后用對應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割。限制性內(nèi)切酶失活后用T4 DNA連接酶將目的基因ILV2、ILV5與強啟動子PGK1p相連后分別插入帶有標(biāo)記基因的高拷貝質(zhì)粒YEplac195和YEplac112中，構(gòu)建重組質(zhì)粒YEplac195-PGK1p-ILV2（Y2）和YEplac112-PGK1p-ILV5-GFP-CYC1（Y5），將目的基因ARO10與強啟動子TDH3p相連后插入帶有標(biāo)記基因的高拷貝質(zhì)粒YEplac181中，構(gòu)建重組質(zhì)粒YEplac181-TDH3p-Cox4-ARO10-GFP-CYC1（Y10），以上3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，通過質(zhì)粒高拷貝數(shù)和強啟動子實現(xiàn)ILV2、ILV5、ARO10基因的過量表達(dá)。以相同的方法將ILV3基因兩端插入帶有δ5'及δ3'基因片段的質(zhì)粒pUC18中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-δ5'-His-PGK1p-ILV3-δ3'（P3），轉(zhuǎn)入釀酒酵母后，該質(zhì)粒以δ整合的方式過量表達(dá)基因ILV3。擴增基因所用引物序列及其酶切位點如表2所示。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細(xì)胞中，涂于完全選擇培養(yǎng)基上，通過質(zhì)粒上的標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子。

1.3.7 微厭氧發(fā)酵

菌株過夜活化后，以初始OD600nm值=0.2接入20 mL完全選擇培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)16 h。取適量菌液以初始OD600nm值=0.2接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基（含40g/L葡萄糖的完全選擇培養(yǎng)基）中，30℃、100 r/min微厭氧發(fā)酵36 h。

1.3.8 菌株生長及發(fā)酵性能的檢測

在發(fā)酵過程的各個時間節(jié)點取樣，利用紫外可見分光光度計和3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法分別測定發(fā)酵液細(xì)胞濃度及殘?zhí)橇浚L制生長曲線和耗糖曲線。利用高效液相色譜與氣相色譜分別測定發(fā)酵液中乙醇及乙酸的產(chǎn)量，其色譜條件為Carbomix H-NP色譜柱（7.8mm×300mm×10μm）及示差折光檢測器，2.5mmol/L H2SO4作為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫55℃，檢測器溫度35℃。采用氣相色譜儀測定異丁醇的產(chǎn)量，其色譜條件為HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.32 mm），柱溫為80℃，維持10 min，進(jìn)樣口溫度穩(wěn)定在200℃，檢測器的溫度穩(wěn)定在300℃。異丁醇產(chǎn)率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 對照型釀酒酵母異丁醇耐受性的測定

由圖1A可知，通過平板稀釋法將培養(yǎng)液的OD600nm值稀釋至10-4時可看到清晰的單菌落，稀釋至10-5未長出單菌落，因此確定將菌液稀釋至10-4后點樣；由圖1B可知，出發(fā)菌株W303-1A在含異丁醇體積分?jǐn)?shù)為2.0%和3.0%的培養(yǎng)基上不能生長。因此，篩選出能對2.0%及更高含量的異丁醇耐受性的菌株具有較高研究意義。

圖1 不同稀釋度培養(yǎng)液（A）和不同含量異丁醇（B）對菌株W303-1A的影響Fig.1 Effect of fermentation broth with different dilutions(A)and different isobutanol contents(B)on the growth of strainW303-1A

2.2 EMS誘變條件的確定

利用EMS可使釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生突變，但過高濃度的EMS會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此，為了得到最佳的突變效果，需要測定相對適宜的EMS誘變濃度。分別用不同濃度的EMS誘變等量活化過的釀酒酵母細(xì)胞W303-1A，誘變完成后分別取適量上述菌液稀釋至10-3涂布于YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并計算致死率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)EMS質(zhì)量濃度為40 μg/mL時，釀酒酵母細(xì)胞致死率為78%，根據(jù)之前的實驗研究，致死率為70%～90%時，EMS的誘變效果最佳[18]。因此，選擇處于最適EMS質(zhì)量濃度即40 μg/mL對菌株W303-1A誘變。

圖2 EMS質(zhì)量濃度與致死率關(guān)系Fig.2 Relationship between EMS concentration and fatality rate

2.3 高異丁醇耐受性菌株的篩選

釀酒酵母菌W303-1A經(jīng)數(shù)次EMS誘變及篩選后，共得到60株突變菌株。結(jié)果見圖3。

圖3 突變菌株在YPD培養(yǎng)基與含2%異丁醇YPD培養(yǎng)基上的篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of mutant strains on YPD medium and YPD medium with isobutanol 2%

由圖3可知，通過對比含在有2%（V/V）異丁醇的YPD培養(yǎng)基上稀釋度為10-3和10-4時的單菌落的個數(shù)及大小可以發(fā)現(xiàn)，1#、10#、18#、20#～22#、24#、26#、28#、30#～32#、37#～40#、42#、44#、47#、49#、50#和57#～60#突變菌株生長相對良好，其中7株可在含3%（V/V）異丁醇的YPD培養(yǎng)基上生長，結(jié)果如圖4所示。

圖4 突變菌株在YPD培養(yǎng)基與含3%異丁醇YPD上的篩選結(jié)果Fig.4 Screening results of mutant strains on YPD medium and YPD medium with isobutanol 3%

由圖4可知，通過對比在含有3%異丁醇的YPD培養(yǎng)基上稀釋度為10-3和10-4時的單菌落個數(shù)及大小可以發(fā)現(xiàn)，18#、38#、39#和40#菌株生長能力較強。因此，選擇18#、38#、39#和40#菌株驗證遺傳穩(wěn)定性后進(jìn)行發(fā)酵性能的檢測。

2.4 突變菌株的發(fā)酵性能檢測

將18#、38#、39#和40#突變菌株及對照菌株W303-1A進(jìn)行微厭氧發(fā)酵，測定其生長曲線和葡萄糖消耗曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 突變菌株與對照菌株的生長（a）及耗糖（b）情況Fig.5 The cell growth(a)and glucose consumption(b)of mutant strains and the control strain

如圖5a所示，39#突變菌株生長速率明顯高于18#、38#、40#突變菌株和對照菌株W303-1A，細(xì)胞濃度最大，OD600nm值達(dá)到16。18#、38#、40#株突變菌株與303-1A的相比，生長速率和細(xì)胞濃度差異不大。

如圖5b所示，39#突變菌株耗糖能力明顯強于18#、38#、40#突變菌株和對照菌株W303-1A，在10 h時葡萄糖基本消耗完。而對照菌株W303-1A在發(fā)酵12 h時將培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡，18#、38#和40#突變菌株在發(fā)酵14 h后逐漸將葡萄糖耗盡。因此，選定異丁醇耐受性最佳、生長能力最強的39#突變株（EMS39）作為宿主菌，進(jìn)一步優(yōu)化其合成異丁醇的能力。

2.5 工程菌株的構(gòu)建及微厭氧發(fā)酵能力檢測

將重組質(zhì)粒Y2、Y5、Y10和P3共轉(zhuǎn)化突變株EMS39和對照菌W303-1A中，得到工程菌株EMS39 23510和W303-1A 23510。將對應(yīng)的4個空載體轉(zhuǎn)化入對照菌W303-1A中得到菌株W303-1A-EP（對照菌）。然后將上述3株菌同時進(jìn)行微厭氧發(fā)酵實驗，在發(fā)酵的各個時間節(jié)點取樣測定菌體生長能力及葡萄糖消耗能力，結(jié)果見圖6。在發(fā)酵的各個時間節(jié)點取樣測定菌株產(chǎn)異丁醇、乙醇和乙酸的能力，各時間節(jié)點發(fā)酵液中異丁醇、乙醇和乙酸的濃度結(jié)果見圖7。

圖6 工程菌和對照菌的生長（a）和耗糖情況（b）Fig.6 The cell growth(a)and glucose consumption(b)of engineering strains and the control strain

如圖6a所示，在發(fā)酵前8h內(nèi)菌株EMS3923510、W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP生長速率基本相同，8 h后菌株EMS39 23510、W303-1A 23510的生長速率高于對照菌，在24 h后3株菌生長濃度達(dá)到最大值。其中菌株W303-1A 23510細(xì)胞濃度最大，生長能力最強，出發(fā)菌株W303-1A細(xì)胞濃度最小，生長能力最弱。

如圖6b所示，菌株EMS39 23510和W303-1A 23510耗糖速度較快，32 h后兩株工程菌的葡萄糖基本耗盡，而菌株W303-1A-EP耗糖速度相對較慢，于48 h后葡萄糖耗盡。由此看出，突變菌株EMS39與出發(fā)菌株W303-1A相比，生長及耗糖能力明顯提高。

圖7 工程菌和對照菌發(fā)酵產(chǎn)異丁醇（a）、乙醇（b）及乙酸（c）結(jié)果Fig.7 Results of isobutanol(a),alcohol(b)and ethanoic acid(c)productions by the fermentation of engineering strains and the control strain

如圖7a所示，菌株EMS39 23510和W303-1A 23510的異丁醇產(chǎn)量在發(fā)酵24h之后逐漸提高。菌株EMS3923510在32 h時異丁醇產(chǎn)量達(dá)到404.2 mg/L，菌株W303-1A 23510在60 h異丁醇產(chǎn)量達(dá)到389.1 mg/L。在整個發(fā)酵期間，對照菌W303-1A-EP的異丁醇質(zhì)量濃度提高并不明顯，在48 h產(chǎn)量最高，為64.2 mg/L。對比3株菌的異丁醇產(chǎn)量可知，菌株EMS39 23510比菌株W303-1A-EP提高了529.6%，比菌株W303-1A 23510提高了3.9%，異丁醇產(chǎn)率達(dá)到10.11 mg/g葡萄糖，與菌株W303-1A-EP相比提高了530.0%。

如圖7b所示，菌株EMS39 23510的乙醇產(chǎn)量依然高于菌株W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP。菌株EMS39 23510乙醇產(chǎn)量于32 h達(dá)到最高，為4 342.9 mg/L，菌株W303-1A 23510和W303-1A-EP和分別于60 h和48 h產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為4 157.6 mg/L和3 449.3 mg/L。

如圖7c所示，菌株EMS39 23510乙酸產(chǎn)量明顯高于菌株W303-1A 23510和W303-1A-EP。菌株EMS39 23510的乙酸產(chǎn)量在32 h之后達(dá)到最大值，為1 196.4 mg/L，并基本維持在1165.1mg/L。而菌株W303-1A 23510和菌株W303-1A-EP的最高乙酸產(chǎn)量分別為454.6 mg/L和434.1 mg/L，發(fā)酵48 h之后產(chǎn)量最低，均為22.4 mg/L。

3 結(jié)論

本實驗利用化學(xué)試劑EMS對釀酒酵母菌株W303-1A進(jìn)行誘變，確定了突變劑EMS作用的最適的質(zhì)量濃度為40 μg/mL。篩選得到60株可在含2%異丁醇的YPD培養(yǎng)基上生長的突變菌株，其中7株可在含3%異丁醇的YPD培養(yǎng)基上生長。通過測定生長和耗糖情況，篩選得到1株遺傳穩(wěn)定、耐受異丁醇良好發(fā)酵優(yōu)勢菌株EMS39。

在EMS39中過量表達(dá)ILV2、ILV5、ILV3和ARO10基因，得到EMS39 23510。發(fā)酵數(shù)據(jù)顯示，菌株EMS39 23510發(fā)酵產(chǎn)物與W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP相比，產(chǎn)量明顯提高，其中異丁醇產(chǎn)量提高尤為明顯，在32 h時達(dá)到404.2 mg/L，比菌株W303-1A-EP提高了529.6%，比菌株W303-1A 23510提高了3.9%；異丁醇產(chǎn)率達(dá)到10.11 mg/g葡萄糖，比菌株W303-1A-EP提高了530.0%；乙醇和乙酸產(chǎn)量較對照菌W303-1A-EP相比分別提高了25.9%和175.6%，與菌株W303-1A 23510相比分別提高了4.5%和163.2%。

菌株EMS39 23510生長和發(fā)酵能力較強，也是基因工程操作的優(yōu)質(zhì)宿主菌。本工作構(gòu)建的突變體庫在釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)異丁醇研究方面具有重要意義，同時，為進(jìn)一步提高微生物發(fā)酵能力提供了新思路，在一定程度上為實現(xiàn)新型能源的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。