李彩霞，張睿睿

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

葡萄為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含鈣、鐵、鉀、鎂和胡蘿卜素、核黃素、維生素C（vitamin C，VC）、葡萄糖、果糖、酒石酸、草酸等多種礦物質(zhì)元素和營(yíng)養(yǎng)成分。具有抗病毒殺菌、抑制腫瘤、抗貧血、降低胃酸、抗動(dòng)脈粥樣硬化、補(bǔ)益大腦和利尿消腫等保健功能；還具有緩解機(jī)體疲勞，降低血糖濃度，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，降壓，抗氧化和美容等藥理作用[1]。枸杞是茄科枸杞屬植物，味甘、性平，屬于衛(wèi)生部公布的藥食同源品種，在我國(guó)和其他的亞洲國(guó)家有超過2000年的種植和食用歷史[2]。其含有豐富的枸杞多糖、β-胡蘿卜素、維生素E（vitamin E，VE）、硒及黃酮類等抗氧化物質(zhì)，有較好的抗氧化作用，此外還具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等作用[3]。

果醋是用水果或果品的加工下腳料為主要原料，利用現(xiàn)代生物技術(shù)釀制而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品，其兼有水果和食醋的營(yíng)養(yǎng)，是集保健、食療等功能為一體的新型飲品[4]。飲用果醋對(duì)人體健康有一定好處，如果能利用多種果蔬，將其制成復(fù)合型果醋，可以使果醋的營(yíng)養(yǎng)種類更為豐富，復(fù)合型果醋也將擁有更廣闊的市場(chǎng)前景[5]。本試驗(yàn)以葡萄和枸杞為原料，采用液態(tài)發(fā)酵法釀制復(fù)合果醋，探討葡萄枸杞復(fù)合果醋適宜的發(fā)酵工藝，以期為葡萄枸杞復(fù)合果醋的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄：產(chǎn)于甘肅張掖；7號(hào)紅枸杞干果：產(chǎn)于甘肅白銀；白砂糖（食品級(jí)）：市售?；钚愿山湍福喊茬鹘湍腹煞萦邢薰?；醋酸桿菌：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。

葡萄糖（分析純）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇（分析純）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；瓊脂：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶（1.2×105U/g）：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQHZ-2002A大容量全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)華美生化儀器廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海璽袁科學(xué)儀器有限公司；pH 510型精密pH計(jì)：上海安萊立思儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合果醋釀造工藝流程及操作要點(diǎn)[6]

原料選擇：葡萄和枸杞應(yīng)選擇成熟、無病和無霉?fàn)€的果實(shí)。

葡萄汁的制備[7]：葡萄去梗后，破碎，并立即添加140mg/L H2SO3（以SO2計(jì)）防止氧化，同時(shí)加入30 mg/L果膠酶，并于低溫條件下浸漬48 h，備用。

枸杞汁的制備[8]：枸杞清洗，40～50℃水浸泡20～30 min，以1∶3（g∶mL）的比例加水破碎打漿、過濾，并在枸杞汁中加入30 mg/L果膠酶與70 mg/L H2SO3（以SO2計(jì)）混勻，低溫條件下浸漬48 h，備用。

調(diào)整糖度、pH值：葡萄汁和枸杞汁按1∶1（mL∶mL）混合后，使用白砂糖調(diào)節(jié)糖度為18°Bx，且在發(fā)酵剛剛開始的時(shí)候一次性加完[9]。之后用pH計(jì)測(cè)定果漿的初始pH值，加入適量的碳酸鈣或酒石酸進(jìn)行降酸或增酸，以便達(dá)到預(yù)定pH值。

酵母的活化[10]：取一定量的活性干酵母，加入其質(zhì)量5%的白砂糖以及20倍質(zhì)量的水，攪拌均勻，置于35～40℃電熱恒溫水浴鍋中30 min，冷卻至28～30℃?zhèn)溆谩?/p>

酒精發(fā)酵：將活化好的酵母（溫差不超過10℃）加入待發(fā)酵液中進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵6～7 d，發(fā)酵期間定期測(cè)定酒精度、相對(duì)密度、溫度、可溶性固形物，當(dāng)相對(duì)密度達(dá)到0.992～0.996時(shí)，終止酒精發(fā)酵，轉(zhuǎn)入醋酸發(fā)酵。

醋酸菌的活化[11]：保藏菌種先經(jīng)斜面活化，32℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)入醋酸菌活化培養(yǎng)基中，4層紗布封口，32℃、120 r/min振蕩進(jìn)行活化，24 h后得到醋酸菌種子液。

醋酸發(fā)酵：將醋酸菌種子液以一定的接種量接種于發(fā)酵液中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在一定的溫度條件下培養(yǎng)一定的時(shí)間，定期測(cè)定酸度，至酸度不再上升時(shí)結(jié)束發(fā)酵，經(jīng)過濾、澄清并于75℃滅菌20 min[12]得到成品復(fù)合果醋。

1.3.2 酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別選取初始pH值（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）、發(fā)酵溫度（22℃、24℃、26℃、28℃、30℃）、酵母添加量（2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）3個(gè)因素進(jìn)行酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)，以酒精度為考察指標(biāo)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，以初始pH值（A）、發(fā)酵溫度（B）、酵母添加量（C）為3個(gè)因素，以酒精度為考察指標(biāo)，優(yōu)化酒精發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、發(fā)酵時(shí)間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、醋酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%）3個(gè)因素進(jìn)行醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)，以總酸（以醋酸計(jì)）含量為考察指標(biāo)。

在單因素水平試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，以發(fā)酵溫度（E）、發(fā)酵時(shí)間（F）、接種量（G）為3個(gè)因素，以總酸含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝條件，正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

（1）感官指標(biāo)測(cè)定

復(fù)合果醋的感官指標(biāo)參照GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》規(guī)定的感官方法進(jìn)行分析。

表3 復(fù)合果醋感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar

（2）理化及微生物指標(biāo)測(cè)定

可溶性固形物：采用手持糖量計(jì)測(cè)定[13]；酒精度：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》執(zhí)行，采用密度瓶法測(cè)定；總糖與還原糖：采用菲林試劑滴定法測(cè)定[14]；總SO2：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》執(zhí)行，采用直接碘量法測(cè)定；總酸：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中電位滴定法測(cè)定；菌落總數(shù)及大腸菌群：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵試驗(yàn)

2.1.1 初始pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖1 初始pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial p H value on alcoholic fermentation

初始pH值低于3.8時(shí)，酒精度隨初始pH的升高而逐漸上升，pH過低，不利于酵母菌的活動(dòng)，酵母生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酒精量較少，此時(shí)提高pH值，可以提高酒精發(fā)酵產(chǎn)物的量；初始pH為3.8時(shí)，酒精度達(dá)到最大，為8.25%vol；初始pH值繼續(xù)增大，酒精度下降，是由于酸度過低，抑制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，不利于酒精發(fā)酵，造成發(fā)酵不徹底，產(chǎn)酒精率下降，甚至?xí)拱l(fā)酵失敗。因此，選擇酒精發(fā)酵的最佳初始pH值為3.8。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵影響高而逐漸升高，是因?yàn)榻湍妇L(zhǎng)對(duì)溫度敏感，升高溫度能加快酵母菌生長(zhǎng)繁殖[16]；發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為8.19%vol，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，會(huì)導(dǎo)致酒精度下降，是由于高溫對(duì)酵母菌生長(zhǎng)不利，使酵母提前出現(xiàn)疲勞狀態(tài)而抑制酒精發(fā)酵，發(fā)酵提前終止，酒精度較低[17]。因此，選擇酒精發(fā)酵最適溫度為28℃。

2.1.3 酵母添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

由圖3可知，酵母添加量為2.0%～6.0%時(shí)，酒精度隨酵母添加量增加而逐漸升高；酵母添加量為6.0%時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為8.15%vol；繼續(xù)增大酵母添加量酒精度反而降低，可能是由于在酒精發(fā)酵前期，酵母過多，會(huì)產(chǎn)生大量的酒精，導(dǎo)致酵母菌生長(zhǎng)受到抑制，酒精度增加緩慢，產(chǎn)酒精量相對(duì)較低[15]。因此，選擇酒精發(fā)酵最適酵母添加量為6.0%。

圖3 酵母添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast addition on alcoholic fermentation

2.2 酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcoholic fermentation

由圖2可知，發(fā)酵溫度為22～28℃時(shí)，酒精度隨溫度升

表5 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results for alcoholic fermentation conditions optimization

從表4、表5可知，3個(gè)因素的主次關(guān)系依次為初始pH值、發(fā)酵溫度、酵母添加量。顯著性檢驗(yàn)表明，初始pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響為極顯著水平（P＜0.01）；溫度對(duì)酒精發(fā)酵為顯著水平（P＜0.05）；酵母添加量對(duì)酒精發(fā)酵影響不顯著（P＞0.05）。最優(yōu)的工藝組合為A3B2C2，即初始pH值為4.0，發(fā)酵溫度為28℃，酵母添加量為6%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得發(fā)酵液中酒精度為8.28%vol，表明優(yōu)化的工藝條件穩(wěn)定。

2.3 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖4可知，在一定溫度范圍內(nèi)，醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖隨發(fā)酵溫度的升高而增加，果醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度升高而逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，總酸含量達(dá)到最大，為3.30 g/100 mL；當(dāng)發(fā)酵溫度升高到一定程度，菌體容易老化，醋酸菌的生長(zhǎng)代謝受到阻礙，醋酸含量下降[18]。因此，選擇30℃為醋酸發(fā)酵的最適發(fā)酵溫度。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

在一定時(shí)間范圍內(nèi)，發(fā)酵液中酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量達(dá)到最大，為3.52 g/100 mL；發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，總酸含量幾乎保持不變，是由于醋酸菌在繁殖初期數(shù)量少，隨時(shí)間延長(zhǎng)醋酸菌大量繁殖，乙酸含量上升，發(fā)酵后期，由于產(chǎn)物抑制作用導(dǎo)致酸含量不再增加，發(fā)酵液中酸含量幾乎保持不變[19]。因此，選擇醋酸發(fā)酵最適時(shí)間為5 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on acetic acid fermentation

2.3.3 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

隨著接種量增大，果醋中總酸含量上升，接種量過低，醋酸菌濃度低，產(chǎn)酸速率慢，提高接種量可使產(chǎn)酸速度加快[20]；接種量為4%時(shí)，總酸含量達(dá)到最大，為3.70 g/100 mL；繼續(xù)增加接種量，由于醋酸菌含量過高，導(dǎo)致發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，影響醋酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵能力，不利于醋酸的積累，產(chǎn)酸速度減緩。因此，選擇醋酸菌最適接種量為4%。

圖6 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

2.4 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

續(xù)表

由表5可知，在試驗(yàn)號(hào)為1、4、5、8的工藝條件下發(fā)酵的果醋，總酸含量均低于3.5 g/100 mL，不符合果醋釀造的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

從極差分析中可以看出，在醋酸發(fā)酵階段3個(gè)影響因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量。可見，在醋酸發(fā)酵工藝中，對(duì)這3個(gè)因素而言，發(fā)酵時(shí)間最為重要，其次是發(fā)酵溫度，接種量對(duì)產(chǎn)酸量影響不顯著。最優(yōu)的工藝組合為E3F3G2，即發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d，醋酸菌接種量為4%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得復(fù)合果醋中總酸含量為4.27 g/100 mL。

2.5 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 感官指標(biāo)結(jié)果

色澤：紅茶色，有光澤；香氣：有枸杞特有的果香味、醋香；葡萄水果的混合香味，香味濃郁協(xié)調(diào)；滋味：口感柔和甘爽，酸甜適中，無澀味，無不良?xì)馕叮惑w態(tài)：體態(tài)澄清透明，無沉淀和懸浮物。

2.5.2 理化指標(biāo)

總酸（以醋酸計(jì)）：4.27 g/100 mL；還原糖（以葡萄糖計(jì)）2.5 g/L；SO2：125 mg/L。以上指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤50 CFU/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

3 結(jié)論

以葡萄和枸杞為原料，通過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩個(gè)階段的試驗(yàn)，研究復(fù)合果醋的最佳生產(chǎn)工藝，結(jié)果表明，酒精發(fā)酵的最佳工藝條件為酵母添加量6.0%、初始pH值為4.0、發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間6 d；醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為醋酸菌接種量4.0%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間6d。此條件下制得的葡萄枸杞復(fù)合果醋呈紅茶色，有光澤；有葡萄、枸杞特有的果香味、醋香，葡萄水果的混合香味，香味濃郁協(xié)調(diào)；口感柔和甘爽，酸甜適中，無澀味，無不良?xì)馕叮惑w態(tài)澄清透明，無沉淀和懸浮物。總酸（以醋酸計(jì)）為4.27 g/100 mL，還原糖（以葡萄糖計(jì)）為2.5 g/L，工藝條件穩(wěn)定。