畢春元，杜 祎，張金玲，高廣恒，史建國(guó)*

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014）

葡萄酒是目前被全球普遍接受的一種酒精飲料，因保健作用及豐富的文化內(nèi)涵越來(lái)越受到國(guó)人的喜愛(ài)。葡萄糖含量是影響葡萄酒質(zhì)量和區(qū)分葡萄酒種類的重要功能性指標(biāo)之一。葡萄汁是釀造葡萄酒的原料，其所含糖類主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖[1-8]，因此建立一種能夠快速準(zhǔn)確專一性檢測(cè)葡萄糖含量的方法對(duì)高品質(zhì)葡萄酒的釀造具有重要的意義。

目前，測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量的方法主要是糖度計(jì)法、二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法、高效液相色譜法和酶法。糖度計(jì)法只能測(cè)定總糖含量；DNS法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣且只能測(cè)定總還原糖含量；高效液相色譜法儀器昂貴，所需試劑多，測(cè)定費(fèi)時(shí)，成本高[9-15]。

本研究采用葡萄糖測(cè)定的酶-電極法，首先在生物傳感分析儀雙電極系統(tǒng)內(nèi)以1‰葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)該方法的線性、穩(wěn)定性、抗干擾性和專一性，最后通過(guò)對(duì)赤霞珠和巨峰兩個(gè)不同品種的葡萄汁中葡萄糖含量進(jìn)行檢測(cè)，建立了葡萄汁中葡萄糖含量的酶電極測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄，巨峰葡萄：均購(gòu)自濟(jì)南七里堡市場(chǎng)；葡萄糖氧化酶（10 U/mL）：Sigma公司；牛血清白蛋白、戊二醛：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站進(jìn)口分裝；“O”型圈、SBA生物傳感分析儀專用稀釋水、緩沖液：山東省科學(xué)院生物研究所自行配制；聚碳酸酯膜、核微孔膜（孔徑0.2 mm）：美國(guó)Nucleopore公司；鉑、銀純度為99.999%：中國(guó)人民銀行濟(jì)南分行。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

SBA-40D型生物傳感分析儀、葡萄糖氧化酶-酶電極、50 μL微量進(jìn)樣器：山東省科學(xué)院生物研究所；MZB-45糖度計(jì)、DHG-9038A烘干箱：上海米青科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

將葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化氫電極（電流型電化學(xué)電極）自組裝成酶電極，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

當(dāng)樣品與酶電極接觸后，會(huì)在電極上發(fā)生如下反應(yīng)：

圖1 葡萄糖氧化酶酶膜與過(guò)氧化氫電極結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of glucose oxidase membrane and hydrogen peroxide electrode

此電流大小與葡萄糖的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，該過(guò)程的實(shí)現(xiàn)如圖2所示。通過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換器將電流大小轉(zhuǎn)化成可以直接讀取的數(shù)字信號(hào)，即可方便準(zhǔn)確快捷的測(cè)定葡萄糖含量。

圖2 SBA-40D型生物傳感分析儀系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of instrument system SBA-40D biosensor analyzer

1.3.2 葡萄糖氧化酶酶膜及酶電極的制備

選取聚碳酸酯膜為固定化載體，首先將“O”型空圈與核微孔膜粘在一起做成載體膜，用蒸餾水沖洗后于60℃烘箱烘40 min，取出備用。

然后將1mL葡萄糖氧化酶與1 mL3%牛血清白蛋白用3.5%戊二醛交聯(lián)，固定化于已經(jīng)制備好的載體膜上，用蒸餾水沖洗后20℃烘干箱烘10 min，取出，獲得葡萄糖氧化酶酶膜，放于4℃冰箱保存，備用。

將過(guò)氧化氫電極表面用蒸餾水清洗，然后用吸水紙擦干，再用電極擦進(jìn)行進(jìn)一步清潔。在電極表面滴一滴SBA專用緩沖液，將制備好的葡萄糖氧化酶酶膜固定化有葡萄糖氧化酶的一側(cè)貼于電極表面，不能有氣泡，獲得葡萄糖氧化酶電極。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品放入稱量瓶中，于104℃烘干箱內(nèi)烘4 h，然后在干燥器內(nèi)冷卻；準(zhǔn)確稱取0.100 0 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水在100 mL燒杯中溶解，并全部轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，定容備用。

1.3.4 葡萄汁待測(cè)樣品溶液的配制

取待測(cè)葡萄樣品適量，洗凈，晾干，打碎，過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取1mL濾液滴入250 mL具塞錐形瓶中，加入99 mL蒸餾水，混勻，擰緊瓶塞，備用。

1.3.5 樣品的測(cè)定

選用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖劑（pH7.2），在SBA-40D儀器上安裝葡萄糖酶電極，接通電源，系統(tǒng)自動(dòng)清洗反應(yīng)池，當(dāng)儀器提示定標(biāo)時(shí)，用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確吸取25 μL按照1.3.3所配制標(biāo)準(zhǔn)液注入儀器反應(yīng)池內(nèi)，儀器自動(dòng)分析，當(dāng)儀器再次提示定標(biāo)時(shí)，用同樣的方法再次注入標(biāo)準(zhǔn)液，直至儀器提示定標(biāo)通過(guò)。然后取1.3.4所配制待測(cè)液注入儀器反應(yīng)池內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，打印測(cè)定結(jié)果。

1.3.6 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的線性

參照1.3.3的方法分別準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為200 mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，參照1.3.5的方法對(duì)每一個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行3次平行測(cè)定，打印測(cè)定結(jié)果，計(jì)算生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的線性。

1.3.7 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的穩(wěn)定性

參照1.3.5的方法，當(dāng)儀器定標(biāo)通過(guò)后，連續(xù)測(cè)定10次，生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的穩(wěn)定性。

1.3.8 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的加標(biāo)回收率

參照1.3.4的方法配制5份葡萄汁樣品待測(cè)溶液A、B、C、D、E，從5個(gè)樣品待測(cè)液中準(zhǔn)確吸取1 mL分別放入5 mL試管內(nèi)，然后依次添加1 mL 100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400mg/L、500mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)號(hào)A1、B1、C1、D1、E1；從A、B、C、D、E 5個(gè)樣品待測(cè)液中準(zhǔn)確吸取1 mL分別放入5 mL試管內(nèi)，分別加入1 mL蒸餾水，混勻，標(biāo)號(hào)A2、B2、C2、D2、E2；測(cè)定10只試管內(nèi)葡萄糖含量，計(jì)算生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的加標(biāo)回收率。

1.3.9 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的專一性檢測(cè)

參照1.3.3的方法分別配制質(zhì)量濃度為1g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、纖維素、淀粉、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液，用1.3.5的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的專一性。

1.3.10 不同方法測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量的對(duì)比

分別取赤霞珠、巨峰兩個(gè)品種，參照1.3.4的方法制得待測(cè)液。采用生物傳感器法、糖度計(jì)法和DNS法分別對(duì)同一種樣品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的線性檢測(cè)

參照1.3.3的方法分別準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照1.3.5的方法對(duì)每一個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行3次平行測(cè)定，葡萄糖測(cè)定的線性關(guān)系結(jié)果如圖3所示。

圖3 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖含量的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship of glucose content by biosensor measurement

由圖3可見(jiàn)，在葡萄糖質(zhì)量濃度0～1 000 mg/L的范圍內(nèi)生物傳感器測(cè)定葡萄糖含量的方法具有很好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.994 8x-3.081，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2.2 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的穩(wěn)定性檢測(cè)

參照1.3.5的方法，當(dāng)儀器定標(biāo)通過(guò)后，連續(xù)測(cè)定10次，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖含量的穩(wěn)定性結(jié)果Table 1 Determination results of the stability of glucose content by biosensor

由表1可見(jiàn)，生物傳感器測(cè)定葡萄糖含量的方法，測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.63%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的加標(biāo)回收率

對(duì)10只試管內(nèi)葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖含量的加標(biāo)回收率Table 2 Adding standard recovery rate of glucose content determination by biosensor

由表2可見(jiàn)，生物傳感器法測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量的加標(biāo)回收率為96.0%～102.4%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的專一性檢測(cè)

參照1.3.3的方法分別配制質(zhì)量濃度為1 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、纖維素、淀粉、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液，用1.3.5的方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 生物傳感器法測(cè)定葡萄糖的專一性測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of specificity of glucose by biosensor

由表3可見(jiàn)，除葡萄糖外，其他糖類基本無(wú)法測(cè)出，因此生物傳感器測(cè)定葡萄糖含量的方法具有很好的專一性。

2.5 不同方法測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量的對(duì)比

分別取赤霞珠、巨峰兩個(gè)品種，參照1.3.4的方法制得待測(cè)液。采用生物傳感器法、糖度計(jì)法和DNS法分別對(duì)同一種樣品進(jìn)行測(cè)定（n=3），對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 生物傳感器法、糖度計(jì)法和DNS法對(duì)葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果的比較Table 4 Comparison of glucose content determination by biosensor,brix and DNS method%

由表4可以看出，生物傳感器法測(cè)定巨峰和赤霞珠兩種葡萄中葡萄糖含量的結(jié)果明顯低于糖度計(jì)法和DNS法，因?yàn)樘嵌扔?jì)法和DNS測(cè)定的是總糖和總還原糖的含量，而生物傳感器法是對(duì)葡萄糖專一性測(cè)定。

3 結(jié)論

本研究建立了生物傳感器法檢測(cè)葡萄汁中葡萄糖含量的方法。在葡萄糖質(zhì)量濃度為0～1 000 mg/L的范圍內(nèi)生物傳感器法測(cè)定葡萄糖含量的線性良好；線性回歸方程為y=0.994 8x-3.081，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9；穩(wěn)定性好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=1.63%；加標(biāo)回收率為96.0%～102.4%。通過(guò)對(duì)DNS法和糖度計(jì)法測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量結(jié)果進(jìn)行比較，表明該方法測(cè)定葡萄汁中葡萄糖含量具有專一性好、準(zhǔn)確度高、分析速度快、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是葡萄汁中葡萄糖含量測(cè)定的理想方法，對(duì)葡萄汁加工過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量控制具有一定的應(yīng)用價(jià)值。