熊振芳 ，熊秋迎 ，萬紅萍 ，時軍

(南昌大學第一附屬醫(yī)院，1、病理科；2、普外科，南昌 330006)

結(jié)直腸癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一。目前，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率高居惡性腫瘤的第3位，而死亡率位居第4位[1]，近年來盡管治療水平明顯提高，但結(jié)直腸癌仍然是主要的致死癌癥之一，晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率尚不足5%[2]。近年來，針對免疫卡控點藥物引領(lǐng)了腫瘤治療進入免疫治療的新時期，也為結(jié)直腸癌的治療提供了新策略。PD-L1（Programmed death ligand-1，程序性死亡分子配體-1）是B7/CD28協(xié)同刺激分子超家族中主要成員之一，起負性調(diào)節(jié)作用。在正常條件下，PD-L1主要表達于淋巴細胞，但在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)有PD-L1的表達[3]。研究表明，很多腫瘤PD-L1蛋白表達與臨床病理因素存在相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤中表達并提示患者預后較差[4-10]。本課題組前期研究結(jié)果也顯示，在結(jié)直腸癌中PD-L1的高表達狀態(tài)和腫瘤浸潤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者生存期顯著相關(guān)，提示PD-L1可以成為結(jié)直腸癌重要的分子生物學標志，對于評估腫瘤免疫逃逸應答水平具有重要的意義。其在結(jié)直腸癌中的生物學功能和臨床應用前景值得深入探討。

基于以上背景，本課題組通過構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)下調(diào)PD-L1基因在直腸癌細胞系中的表達，觀察PD-L1表達下調(diào)后對細胞生物學功能的影響，探討PD-L1對結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 3種結(jié)直腸癌細胞系 （HT-29、

通信作者：時軍HR8348、SW480）、 細胞裂解液、FBS 胎牛血清、DMEM高糖完全培養(yǎng)基、DMSO凍存液、總RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、流式細胞儀、PCR擴增儀。

1.2 方法

1.2.1 實驗共分3組 PD-L1沉默慢病毒組、空載體組、空白組。

1.2.2 慢病毒包裝 ⑴取生長狀態(tài)良好的細胞，0.05%-0.25%胰酶消化后，懸浮細胞，接種于培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜）；⑵去除培養(yǎng)液，換Opti-MEM培養(yǎng)液；⑶質(zhì)?；旌希合駿P管中加入 250μl無血清 Opti-MEM、0.5μg表達質(zhì)粒和1.5μg包裝混合質(zhì)粒，室溫孵育5min；⑷Lipo稀釋：向EP管中加入250μl Opti-MEM和9μl脂質(zhì)體，室溫孵育5min；⑸將脂質(zhì)體溶液和DNA溶液混勻，室溫孵育20min；⑹胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞；⑺向六孔板中加入DNA-脂質(zhì)體混合物和含血清的生長培養(yǎng)基；⑻將重懸的細胞加到平板中，37℃，5%CO2孵育過夜；⑼除去含有DNA-脂質(zhì)體復合物的培養(yǎng)基，代之以DMEM；⑽48-72h之后收集含病毒的上清，3000rpm離心20min，去除沉淀，病毒上清于－80°C冰箱貯存。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 ⑴當細胞的融合度滿意時，棄除培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化3min；⑵加入DMEM，將細胞吸取到離心管中離心，取沉淀物，再加入DMEM完全培養(yǎng)基并分別接種到6孔板、24孔板和96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5%CO2）；⑶細胞生長狀態(tài)良好時，分別進行空白對照、空載體、沉默PD-L1轉(zhuǎn)染。

1.2.4 流式檢測細胞凋亡和細胞周期 ⑴轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化1min，再加入含10%FBS的DMEM；⑵將細胞吸取到1.5ml離心管中離心，棄除上清，用PBS洗滌2次，收集細胞；⑶將細胞分為兩份，一份用Binding Buffer懸浮細胞，再加入 5μl Propidium Iodide和 5μl Annexin V-FITC，常溫避光孵育5-15min，于1h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡；⑷另一份加入70%的乙醇溶液充分固定2h，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 侵襲實驗 ⑴細胞轉(zhuǎn)染48h后，將侵襲小室放入10%中性福爾馬林固定液中固定15min；⑵取出侵襲小室，用PBS洗滌2次，放入新鮮配制的姬姆薩染色液中反應15min；⑶取出侵襲小室，將小室內(nèi)部細胞用濾紙擦去，顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6 劃線實驗 ⑴當6孔板中的細胞鋪滿板底后，用槍頭垂直于孔板間隔相同距離劃痕；⑵取出孔板，用PBS清洗劃痕上的細胞碎片；⑶加入無血清培養(yǎng)基后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，間隔4-6h拍照記錄。

1.2.7 細胞增殖和毒性檢測 ⑴細胞消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；⑵96孔板每孔接種約4000個細胞，每孔加入100μl的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育；⑶待細胞生長狀態(tài)良好時轉(zhuǎn)染相應慢病毒；⑷48h后，棄除培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的毒性檢測液CCK8 10μl；⑸培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，用酶標儀檢測波長為450nm的OD值。實驗重復3次，取平均值作為最終實驗結(jié)果。按公式計算生長抑制率=[(對照組OD-實驗組OD)/對照組 OD]×100%。

圖2 HR8348細胞系實驗分組的凋亡圖

圖3 SW480細胞系實驗分組的凋亡

2.2 流式檢測細胞周期 ⑴HT-29細胞：與對照組比較，空載組細胞周期變化不明顯，而PD-L1基因沉默組中S期細胞比例減少，G1期細胞比例明顯增多。⑵HR8348細胞和SW 480細胞：與對照組比較，PD-L1基因沉默組和空載組的細胞周期比例變化不明顯。見圖4-6。

2 結(jié)果

2.1 流式檢測細胞凋亡 每種結(jié)直腸癌細胞系3個不同實驗組中，與對照組及空載組比較，PD-L1基因沉默組凋亡率顯著增加。說明PD-L1基因沉默后，可以促進細胞凋亡。見圖1-3。

圖4 HT-29細胞系實驗分組的細胞周期圖

圖1 HT-29細胞系實驗分組的凋亡圖

圖5 HR8348細胞系實驗分組的細胞周期圖

圖6 SW 480細胞系實驗分組的細胞周期圖

2.3 侵襲實驗 ⑴HT-29細胞：PD-L1基因沉默后，細胞侵襲能力降低。空載組、對照組、PD-L1基因沉默組細胞侵襲數(shù)目分別為46個、27個、17個。⑵HR8348細胞：PD-L1基因沉默后，細胞侵襲能力顯著降低?？蛰d組、對照組PD-L1基因沉默組細胞侵襲數(shù)目分別為127個、140個、48個。⑶SW480細胞：PD-L1基因沉默后，細胞侵襲能力有所降低。空載組、對照組、PD-L1基因沉默組細胞侵襲數(shù)目分別為78個、98個、59個。說明PD-L1表達下調(diào)后，細胞侵襲能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖7-10。

2.4 劃線實驗 每種結(jié)直腸癌細胞系3個不同實驗組中，與對照組及空載組比較，PD-L1基因沉默組細胞遷移能力顯著被抑制。見圖11。

圖7 HT-29細胞系實驗分組的細胞侵襲圖

圖8 HR8348細胞系實驗分組的細胞侵襲圖

圖9 SW 480細胞系實驗分組的細胞侵襲圖

圖10 3種細胞系實驗分組的細胞侵襲數(shù)目柱狀圖

圖11 3種細胞系實驗分組的細胞遷移距離柱狀圖

2.5 細胞增殖和毒性檢測 下調(diào)PD-L1表達，能顯著抑制3種細胞系的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖 12。

圖12 3種細胞系實驗分組CCK8檢測OD圖

3 討論

PD-1是協(xié)同刺激受體，是免疫球蛋白超家族成員之一，主要功能是傳導抑制信號的。其配體即為共刺激分子PD-L1，是首個被鑒定的負性共刺激分子，屬B7超家族成員。生理狀態(tài)下，PD-L1表達于免疫細胞、抗原提呈細胞等表面。PD-1/PD-L1信號傳導通路能傳遞抑制性信號，誘導免疫細胞發(fā)生凋亡，調(diào)節(jié)機體免疫應答反應。越來越多的研究表明PD-1/PD-L1通路在腫瘤浸潤和進展過程中發(fā)揮重要的作用，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)有PD-L1的過表達，而且還與腫瘤的惡性生物學行為及生存預后相關(guān)，是目前惡性腫瘤免疫治療策略中的熱門分子靶點。

本課題組前期實驗也驗證了在結(jié)直腸癌中PD-L1的過表達與腫瘤惡性生物學行為及患者的生存預后密切相關(guān)。為了進一步探索PD-L1對結(jié)直腸癌細胞生物學功能的影響，本課題組構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)下調(diào)PD-L1在直腸癌細胞系中的表達，然后進行一系列的分子生物學實驗，研究下調(diào)PD-L1分子的表達對細胞生物學功能的影響，進一步闡明PD-L1分子在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。結(jié)果表明下調(diào)PD-L1的表達，可以抑制癌細胞的高侵襲性，抑制細胞周期，促進癌細胞凋亡，降低結(jié)直腸癌細胞的體外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。綜合目前已有的研究和本課題組研究成果，我們證明了下調(diào)PD-L1的表達能夠抑制結(jié)直腸癌細胞生長，進一步論證了PD-L1能夠直接影響腫瘤細胞惡性生物學功能，但其具體的信號傳導通路及調(diào)控網(wǎng)絡如何發(fā)揮作用有待進一步探討。

最新研究發(fā)現(xiàn)，PD-1阻斷劑對PD-L1過表達患者的治療更加有效[11-13]。因此，阻斷PD-1/PD-L1信號傳導通路為腫瘤免疫治療翻開了新篇章，其相關(guān)抗體及抑制劑在很多臨床試驗也取得了一定的研究成果，這為結(jié)直腸癌的治療帶來了曙光。

一般認為，PD-L1分子主要通過與受體PD-1結(jié)合后起到免疫抑制和免疫逃逸作用，其自身缺乏信號傳導能力。Cao等發(fā)現(xiàn)，PD-L1可增強腫瘤細胞Slug和Twist的表達，抑制E-cad的表達，從而誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的發(fā)生[14]。而Hallett等結(jié)果顯示，PD-L1分子可以不依賴于PD-1，自身作為功能分子，為腫瘤細胞傳導生長抑制信號[15]。由此推測，PD-L1自身即可調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的生物學功能，對抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤進展有重要作用。

PD-L1的表達調(diào)控通路在不同組織學類型的惡性腫瘤中可能不盡相同，正因如此，在腫瘤免疫治療的臨床試驗中單一使用抗PD-L1抗體或抑制劑并不都能達到理想效果。進一步明確這些網(wǎng)絡調(diào)控通路中的相關(guān)分子，聯(lián)合抑制這些分子靶點可能會有更加明確的療效。

綜上所述，本研究顯示，單獨下調(diào)結(jié)直腸癌細胞中的PD-L1的表達，促進癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖、遷移和高侵襲性，降低癌細胞的惡性生物學行為。