梁藝懷，張京佶，張琨，王綠平，殷浩文

(上海市檢測中心 生物與安全檢測實驗室，上海 201203)

在化學品生態(tài)毒性試驗體系中，魚類作為水生生態(tài)毒性試驗體系中的頂級脊椎動物，具有不可替代的地位。因此，早在化學品安全管理體系建立之初，發(fā)達國家就通過大量標準化研究推出了具有科學基礎、符合管理要求的代表性試驗魚種。國際標準化組織(ISO)在20世紀80年代即推薦斑馬魚(Daniorerio)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)、藍鰓魚(Lepomismacrochirus)和青鳉(Oryziaslatipes)等魚種作為為毒性試驗材料魚。在經(jīng)濟全球化的時代，化學品安全管理早已突破地域的限制，發(fā)達國家將管理體系和標準化技術(shù)的優(yōu)勢擴大到化學品的整個生命周期，延伸到貿(mào)易活動的各個層面。

試驗生物的選擇需要考慮區(qū)域生態(tài)相關(guān)性。中國是一個幅員遼闊、生態(tài)系統(tǒng)類型完整的國家，在物種標準化過程中不應該忽視生態(tài)特殊性和脆弱性。在中國的化學品環(huán)境管理中，通過標準化研究推出中國特有的受試生物，既能精準保護我國的生態(tài)環(huán)境安全，又可對歐美發(fā)達國家主導的化學品測試體系進行補充。稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)是我國特有的一種小型鯉科魚類，已實現(xiàn)常年實驗室人工繁殖[1]。因其生物學特征研究已較為系統(tǒng)，國內(nèi)許多科研單位、測試機構(gòu)使用稀有鮈鯽開展生命科學研究或生態(tài)毒性檢測[2-4]。

稀有鮈鯽是我國化學品魚類測試方法標準化的首選魚種。在完成稀有鮈鯽急性毒性試驗適用性驗證工作[5]后，首個以稀有鮈鯽為標準實驗生物的國家標準《GB/T 29763-2013化學品 稀有鮈鯽急性毒性試驗》[6]已經(jīng)頒布實施。然而，急性毒性試驗只是諸多魚類試驗中的一項，遠遠不能滿足化學品的危害評估和風險評估的數(shù)據(jù)要求。實驗生物在承受長時間、低劑量的受試物質(zhì)暴露時，所處生命周期的階段不同，毒性效應的發(fā)生機制和出現(xiàn)時間都可能存在很大差異，比單純的急性毒性試驗能夠提供更多有價值的數(shù)據(jù)信息。在開展化學品風險評估時，慢性毒性數(shù)據(jù)種間外推的不確定性和評估因子較小，能夠優(yōu)化風險評估的結(jié)論。因此，對于我國特有實驗魚種用于化學品生態(tài)毒性測試的標準化戰(zhàn)略，將稀有鮈鯽的毒性測試標準從急性毒性延長到慢性毒性、從單一的死亡終點擴展到發(fā)育、生殖等更多的效應終點，具有重要的現(xiàn)實意義[7]。

本研究旨在驗證稀有鮈鯽對魚類幼體生長試驗的適用性，為國家標準編制項目《化學品稀有鮈鯽幼體生長試驗》(20140324-T-469)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究中各實驗室所使用的動物源自中國科學院水生生物研究所構(gòu)建的稀有鮈鯽IHB系(野生型封閉群)或引種后自行繁育， SPF級。單次試驗所用幼魚均為同一批次，初始魚齡2～3個月，初始體重0.05～0.10 g。在試驗開始前，幼魚在試驗條件下至少馴養(yǎng)兩周。

1.1.2 參比物質(zhì)

重鉻酸鉀(potassium dichromate，K2Cr2O7，GR，上海國藥集團化學試劑有限公司，批號20140708)，是水生毒性試驗中常用的無機參比物質(zhì)。其性質(zhì)穩(wěn)定，試驗結(jié)果可靠，可比性強。

3,4-二氯苯胺(3,4-dichloroaniline，C6H5Cl2N，98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號C10012181)，其水溶性較低、毒性大，是常用的有機參比物質(zhì)。

1.2 方法

按照《OECD化學品測試準則No.215魚類幼體生長試驗》[8]和ISO關(guān)于測試方法和結(jié)果的準確度評價方法[9]進行試驗設計并制定試驗方案，選用重鉻酸鉀和3,4-二氯苯胺兩種參比物質(zhì)，分別進行三次實驗室內(nèi)稀有鮈鯽幼體生長試驗，評價試驗結(jié)果的重復性(repeatability)；同時邀請國內(nèi)同類實驗室開展針對上述兩種參比物質(zhì)的比對試驗，評價試驗結(jié)果的再現(xiàn)性(reproducibility)。

1.2.1 試驗原理

將處于指數(shù)生長階段的幼魚稱重后放入試驗容器中，并在受試物的亞致死濃度范圍內(nèi)進行更新式暴露，試驗周期為28 d。每天投餌，投餌量根據(jù)魚的初始重量計算。試驗結(jié)束時，再次對試驗魚稱重。通過回歸模型來估計引起20%生長率變化的濃度(EC20)，從而分析對其生長率的影響；通過與空白對照組的比較可以確定最低可觀察效應濃度(LOEC)以及無可觀察效應濃度(NOEC)。

1.2.2 試驗條件

試驗用水為經(jīng)活性炭過濾，紫外滅菌的自來水，pH 6.0～8.5，總硬度不低于 140 mg/L(以 CaCO3計)；溫度(23±2)℃；每天12 h光照；溶解氧不小于空氣飽和值的60%。飼喂：每日投食2次且間隔至少5 h，投食總量約為每個容器中所有魚初始體重的4%，稱重前24 h內(nèi)不飼喂。清污：每次更換試驗溶液時，將原有試驗容器替換為充分洗凈的試驗容器。

1.2.3 試驗操作

暴露濃度：重鉻酸鉀暴露組為10、15、22、33、50 mg/L，3,4-二氯苯胺暴露組為20、36、64、112、200 μg/L，同時設1個空白對照組(試驗用水)；各組設3個平行，每個平行容器放入5尾魚。每次試驗需使用90尾魚。

試驗開始前，選擇試驗魚中有代表性的個體，用80 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)麻醉后，測量平均體重。在試驗開始時，對所有試驗用魚逐尾稱重，所有個體重量應保持在平均體重的±10%范圍內(nèi)，最大不能超過25%。將試驗魚在試驗容器之間隨機分配，并記錄每個試驗容器中魚的總重量。

試驗結(jié)束時，對所有存活的魚按試驗容器逐尾稱重。試驗期間，不進行測量。

觀察和記錄：每日一次觀察并記錄魚死亡數(shù)量和其他異?，F(xiàn)象，如體表出血、變色等。死魚應及時清除，且需重新調(diào)整投餌量。

試驗期間，測定一次空白對照組和最高濃度組中的總硬度；至少在一個試驗容器中連續(xù)監(jiān)測溫度。

至少在每次更新試驗溶液前后測定各試驗容器中溶液pH、溶解氧和溫度。

1.2.4 試驗有效性判斷

試驗期間，試驗溶液的溶解氧含量應>60%ASV；各試驗容器之間的水溫波動不超過±1℃，并且應保持在試驗生物適宜溫度的±2℃范圍內(nèi)。

試驗結(jié)束時，對照組試驗魚的死亡率不得超過10%，且對照組試驗魚平均體重的增長至少為初始體重的50%。

1.2.5 實驗室內(nèi)重復試驗

重鉻酸鉀和3，4-二氯苯胺稀有鮈鯽幼體生長試驗在實驗室內(nèi)各實施三次，通過固定試驗條件和方法，在不同時間、不同操作人員、不同受試生物個體，比較分析試驗結(jié)果的重復性。

1.2.6 實驗室間比對試驗

為評價兩種參比物質(zhì)試驗結(jié)果的再現(xiàn)性，邀請五家外部實驗室參加稀有鮈鯽幼體生長比對試驗。這些實驗室位于我國不同區(qū)域，其中華東2家，東北1家，華中1家，西南1家。為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和可比性，比對試驗由本實驗室制定試驗方案，統(tǒng)一分發(fā)受試物質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 平均特定生長率

平均特定生長率是指某個試驗濃度中整個容器中魚的平均生長率，計算公式(1)如下：

(1)

1.3.2 結(jié)果的回歸分析

將各暴露組的平均特定生長率(r)與空白對照組平均特定生長率(r0)進行對比，計算得出以特定生長率為基礎的抑制率(Ir)，再運用概率單位法分析抑制率(Ir)與濃度之間的數(shù)學關(guān)系，可估算ECx，即任何所需EC值。計算生長抑制率(Ir)的公式(2)如下：

(2)

(2)式中，Ir： 以特定生長率為基礎的抑制率，%；r0、r分別為空白對照組平均特定生長率和暴露組平均特定生長率。

1.3.3 LOEC和NOEC的估計結(jié)果分析

采用Dunnett’s t檢驗將各暴露組平均特定生長率(r)與空白對照組平均特定生長率(r0)進行對比，確定LOEC和NOEC值。

以上EC、LOEC和NOEC值均基于參比物質(zhì)在試驗溶液中的配制濃度。

2 結(jié)果

2.1 實驗室內(nèi)重復試驗

兩種參比物質(zhì)的實驗室內(nèi)稀有鮈鯽幼體生長重復試驗結(jié)果顯示(表1)，重鉻酸鉀和3,4-二氯苯胺三次試驗結(jié)果的變異系數(shù)分別為11.3%和14.2%，均小于15%。兩種參考物質(zhì)在三次試驗中得到的LOEC和NOEC值均一致。這表明在實驗室內(nèi)部開展的稀有鮈鯽幼體生長試驗結(jié)果的重復性好。

表1 重復試驗中兩種參比物質(zhì)對稀有鮈鯽28 d生長抑制效應濃度(28 d EC20)Table 1 Effects of the two reference chemicals on the specific growth rate of Gobiocypris rarus after 28 d of exposure (28 d EC20) in the repeated tests

2.2 實驗室間比對試驗

所有參加比對試驗的實驗室均按照統(tǒng)一的試驗方案開展稀有鮈鯽幼體生長試驗，試驗用水水質(zhì)參數(shù)(溫度、pH、溶解氧濃度、硬度等)的波動和試驗用魚的選擇均符合質(zhì)量控制要求。試驗結(jié)束時，各次試驗對照組試驗魚的死亡率均為0，且平均體重的增長超過初始體重的50%，均符合試驗有效性要求。

通過Dunnett’st檢驗，將各暴露組的平均特定生長率均值與空白對照組進行比較，獲取28 d生長抑制效應的LOEC和NOEC。各實驗室重鉻酸鉀比對的LOEC在15～33 mg/L之間，NOEC在10～22 mg/L之間(圖1)。通過回歸分析，建立暴露濃度與抑制效應的關(guān)系曲線，獲取EC20，各實驗室重鉻酸鉀比對結(jié)果范圍在17.9～30.4 mg/L之間(圖2)。同樣，在3,4-二氯苯胺比對試驗中，LOEC和NOEC分別在36～112 μg/L和 20～64 μg/L范圍內(nèi)(圖3)，EC20在58.4～198 μg/L之間(圖4)。

注：APM1代表上海市檢測中心實驗室第一次試驗的結(jié)果，余同。圖1 各實驗室重鉻酸鉀對稀有鮈鯽特定生長率的28 d LOEC和NOECNote. APM1 stands for the result obtained from the first test by the Shanghai Academy of Public Measurement, and the same can be seen in other figures.Figure 1 The LOEC and NOEC of potassium dichromate on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖2 各實驗室重鉻酸鉀對稀有鮈鯽特定生長率的28 d EC20及其95%置信限Figure 2 EC20 values with 95% confidence limits of potassium dichromate on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖3 各實驗室3,4-二氯苯胺對稀有鮈鯽特定生長率的28 d LOEC和NOECFigure 3 LOEC and NOEC of 3,4-dichloroaniline on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖4 各實驗室3,4-二氯苯胺對稀有鮈鯽特定生長率的28 d EC20及其95%置信限Figure 4 EC20 estimates with 95% confidence limits of 3,4-dichloroaniline on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

3 討論

魚類幼體生長試驗(OECD TG 215)選取處于指數(shù)生長階段的幼魚進行為期28 d的毒性試驗，觀察受試物的亞致死效應以及分析其對生長率的影響[7]。根據(jù)實驗生物的生命周期排列，該測試方法之前有魚類胚胎-卵黃囊吸收階段的短期毒性試驗(OECD TG 212)[11]、魚類早期生活階段毒性試驗(OECD TG 210)[12]，之后有魚類短期繁殖試驗(OECD TG 229)[13]或魚類性發(fā)育試驗(OECD TG 234)[14]，處于一個承前啟后的位置，且技術(shù)難度較小，實驗室間比對工作相對容易開展。

魚類幼體生長試驗從方法開發(fā)之初，其間開展比對驗證，到最終形成OECD導則，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)都是受試魚種或推薦魚種。英國實驗室間比對項目中，3,4-二氯苯胺對虹鱒的28 d LOEC在30～220 μg/L范圍內(nèi)[15]，而之后的歐洲多家實驗室的比對研究得到了一個略大的28 d LOEC范圍(100～600 μg/L)[16]。而在本研究中，國內(nèi)各實驗室的3,4-二氯苯胺對稀有鮈鯽的28 d LOEC在36～112 μg/L之間，表明稀有鮈鯽對3,4-二氯苯胺的敏感性與虹鱒大致接近，這使得將稀有鮈鯽列為魚類幼體生長試驗的受試生物具備可行性。

任何一項試驗研究在實施過程中都會出現(xiàn)各種來源的變異(variations)。就魚類幼體生長試驗而言，除了幼魚個體內(nèi)在的生長率差異，試驗體系中試驗魚的承載量、水溫及其波動幅度、溶解氧含量、投餌量及飼喂頻率等因素都可能對最終的試驗結(jié)果造成不同程度的變異，操作人員和實驗室環(huán)境設施的差異會進一步加劇這種情況，故同一項試驗結(jié)果的實驗室間變異通常比實驗室內(nèi)變異大。然而，只要關(guān)鍵性的試驗條件受到嚴格控制，這些潛在的變異將不會對試驗方法的靈敏度產(chǎn)生顯著的影響。

本研究的發(fā)現(xiàn)進一步驗證了魚類幼體生長試驗方法的穩(wěn)健性[16]。實驗室內(nèi)部研究顯示，兩種參比物質(zhì)重復性試驗得到的LOEC和NOEC值均是一致的，28 d EC20值的變異系數(shù)小，表明試驗結(jié)果的重復性良好。這說明只要選擇來源固定、魚齡適宜、初始體重差異小的稀有鮈鯽幼魚，在暴露條件相同的前提下，即使是不同人員在不同時間進行試驗操作，都能夠獲得一致性較高的試驗結(jié)果。

在比對研究中，各家實驗室均按照統(tǒng)一的試驗方案完成了兩種參比物質(zhì)的稀有鮈鯽幼體生長試驗。各實驗室間數(shù)據(jù)的離散程度(變異系數(shù))相較于同一實驗室內(nèi)數(shù)據(jù)的離散程度大，尤其是3,4-二氯苯胺的試驗數(shù)據(jù)，變異系數(shù)高達42.1%，可能是由于該物質(zhì)難溶于水、毒性效應濃度低、試驗技術(shù)難度較大所致。與此相反，對于水溶性高、性質(zhì)穩(wěn)定的重鉻酸鉀，比對試驗的變異系數(shù)(17.3%)與重復試驗的變異系數(shù)(11.3%)差異不大。同其他實驗室的數(shù)值相比，4號實驗室提供的兩種參比物質(zhì)EC20值均是最小的，即便如此，最大值與最小值之比未超出一個數(shù)量級，而z分數(shù)法的評價結(jié)果也進一步印證了比對試驗結(jié)果的再現(xiàn)性。另外，根據(jù)新化學物質(zhì)危害評估導則[17]判定受試物質(zhì)危害等級判定時，數(shù)據(jù)上的差異并未對毒性分級造成影響。

與魚類急性毒性試驗相比，魚類幼體生長試驗對受試生物、試驗條件、觀察終點、數(shù)據(jù)分析等各方面的技術(shù)要求更為復雜。為了準確描述受試化學物的毒性特征，試驗數(shù)據(jù)需要滿足統(tǒng)計功效，才能將不同暴露濃度組間幼體生長差異與各濃度組中容器內(nèi)個體差異或容器間差異有效區(qū)分開來。實現(xiàn)上述目標的一個關(guān)鍵因素就是挑選出一批初始體重差異較小(所有個體重量須保持在平均體重的±10%范圍內(nèi))的試驗用幼魚。稀有鮈鯽幼魚個體(0.05～0.10 g)遠小于OECD TG 215[8]首選的虹鱒幼魚(3～5 g)，這給動物的移動、稱量和篩選帶來一定技術(shù)難度。然而，使用小型魚種也有一些優(yōu)勢，比如可以縮小試驗體系的規(guī)模，減少配制試驗溶液的工作量。另外還需注意的是，試驗期間務必消除或盡量減小環(huán)境因素(尤其是溫度差異)對幼體生長速率造成的影響，除了將水溫波動嚴格控制在1℃以內(nèi)，還應該定期變換容器位置。

幼魚對環(huán)境壓力的耐受程度遠不及成魚，不適合遠距離運輸，建議有條件的實驗室在內(nèi)部維持適量的稀有鮈鯽種群，以便試驗的順利開展。目前實驗稀有鮈鯽的養(yǎng)殖和病原體控制有些研究，但未形成規(guī)范性體系，這需要各相關(guān)機構(gòu)不斷積累實踐經(jīng)驗、深入研究，盡快形成技術(shù)規(guī)范，為稀有鮈鯽國家標準體系的構(gòu)建奠定基礎。

總之，無論是試驗物種的敏感性，還是試驗結(jié)果的重復性和再現(xiàn)性，均證實了稀有鮈鯽在魚類幼體試驗方法中的適用性。只要相關(guān)研究機構(gòu)繼續(xù)遵從與國際一致的標準化原則，在化學品測試實踐中不斷累積物種穩(wěn)定性和敏感性數(shù)據(jù)，稀有鮈鯽在化學品毒性測試中的使用范圍將有望進一步擴大。