陳靜，姚薇，韓克光*，鄭明學，古少鵬，張鼎，田文霞，霍乃蕊*

(1. 山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801； 2. 山西農業(yè)大學食品與工程學院，山西 太谷 030801)

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的全身性骨代謝病[1]，正常的骨代謝過程中，骨吸收和骨形成處于動態(tài)平衡。研究表明OP發(fā)生時，OC過度形成和活化，骨吸收活性異常增加，導致骨流失加快，骨量減少，骨質劣變[2-3]。因此抑制OC形成及其骨吸收活性是OP防治的一個重要策略。鈣制劑在OP防治中的作用，已被大量研究證實[4]。作為第四代鈣制劑，肽鈣螯合物溶解性和解離性好，生物利用度高，且其中的肽可促進鈣離子的轉運和吸收[5]。

課題組前期研究結果已證實了羊骨髓肽(sheep bone marrow polypeptides，MP)及其鈣螯合物(MP-Ca)對去卵巢大鼠骨質疏松的防治效果[6]。本研究將以RAW264.7為破骨前體細胞，建立OC的RANKL誘導體系，研究MP和MP-Ca對OC誘導形成和活性的影響，并將二者的效果進行比較，揭示其抑制OP發(fā)生的機制，為OP防治藥物研發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MP由內蒙古錫林郭勒盟肽好生物制品有限責任公司生產、分離和純化，以干基計，蛋白含量為96%。小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7和RPMI 1640不完全培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。完全培養(yǎng)基在不完全培養(yǎng)基中補充10%的胎牛血清(浙江)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒、TRAP酶活性檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司；MTT試劑盒與Triton X-100為Solarbio產品；RANKL和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液分別為美國Peprotech和Sigma產品；茚三酮試劑。

JEOL JEM-6490LV掃描電子顯微鏡(日本電子光學實驗室，日本)；6孔和24孔細胞培養(yǎng)板(Corning，美國)；Olympus CX21倒置相差顯微鏡；MC721酶聯免疫檢測儀(上海箐華科技儀器有限公司)。

1.2 MP-Ca的制備與鑒定

以MP和CaCl2為原料，按照實驗室優(yōu)化的螯合工藝制備MP-Ca凍干粉[7-8]。對MP-Ca鑒定時，先對其進行純化，除去樣品中的游離的氨基酸和肽，具體操作為：在MP-Ca溶液中加5～8滴茚三酮試劑，加熱至沸騰，若溶液變?yōu)樗{紫色，說明樣品中仍有游離的氨基酸或小肽，需要繼續(xù)對樣品進行醇沉純化，直至加入茚三酮試劑不再變色。溶解純化后的MP-Ca樣品，加入過量的硫化鈉，振蕩搖勻，放置一段時間，若有硫化鈣沉淀生成，說明鈣離子來自于肽鈣螯合物，過濾掉沉淀，濾液中加入茚三酮試劑，如果顏色變?yōu)樗{紫色，說明溶液中的肽來自肽鈣螯合物。

取適量MP和MP-Ca樣品送至山西農業(yè)大學實驗中心，進行掃描電鏡分析。

1.3 破骨細胞誘導體系的建立

RAW264.7細胞用完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，換液培養(yǎng)。待細胞貼壁達到瓶底面積70% ～80%時，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集消化液，1000 r/min離心5 min，細胞用完全培養(yǎng)基重懸后傳代。

取對數期的RAW264.7細胞用含RANKL(終濃度為50 ng/mL)的完全培養(yǎng)基制成濃度為104個/mL的細胞懸液。在6孔培養(yǎng)板小孔中預置無菌蓋玻片(1 cm × 1 cm)和骨片(0.5 cm × 0.5 cm，厚20 μm)，每孔加入1 mL上述細胞懸液，培養(yǎng)約4 h，待細胞貼壁后在小孔中補加含50 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基，隔天換液，期間觀察細胞形態(tài)。

于培養(yǎng)第3天開始，每24 h取出一枚蓋玻片和骨片，蓋玻片按TRAP染色試劑盒說明進行TRAP染色，骨片超聲清洗后，梯度乙醇脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍室溫染色3～4 min，蒸餾水洗。將蓋玻片和骨片置光鏡下觀察，確定破骨細胞誘導形成的時間。

1.4 MTT法測定細胞生長曲線及受試物的最適干預濃度

96孔板上，RAW264.7細胞(104個/mL)的接種量為100 μL/孔，誘導組小孔中RANKL的終濃度為50 ng/mL，對照組小孔不加RANKL。每組8個平行，每個平行5個復孔，每天取一個平行進行測定，各孔按照MTT試劑盒說明進行操作，并測定OD490值，繪制細胞生長曲線，確定OD490峰值所對應的檢測天數，并以此作為確定各受試物最適作用濃度時的檢測時間。

按1.3建立誘導體系，以不同濃度的受試物干預RANKL誘導的RAW264.7細胞向OC分化的過程。MP，MP-Ca濃度分別為0，10，102，103，104，105μg/mL，17β-雌二醇(E2)濃度為0，1，10，102，103，104μg/mL，于培養(yǎng)第5天用MTT法進行檢測，確定各受試物的最適作用濃度。

1.5 最適作用濃度下受試物對破骨前體細胞分化增殖的影響

按1.3建立誘導體系，以等體積最適作用濃度的MP，MP-Ca及E2干預RAW264.7的RANKL誘導分化的過程，同時設空白組，每組10個平行，每個平行5個復孔，每隔24 h進行MTT測定，記錄OD490值并繪制各組細胞生長曲線。其中一個平行與骨磨片共培養(yǎng)，于第5天進行骨吸收陷窩計數，另取一個平行于第5天測定TRAP活性。

1.6 TRAP活性的測定

吸棄培養(yǎng)基，細胞用PBS洗滌兩次，每孔加入200 μL 0.2% Triton X-100裂解細胞。取100 μL細胞裂解液，按TRAP酶活性檢測試劑盒說明進行操作，測定OD405值。另取100 μL細胞裂解液按BCA蛋白濃度測定試劑盒進行操作并測定OD562值。按式(1)將OD562值換算成細胞裂解液總蛋白濃度，式中標準樣品濃度為563 μg/mL。

定義在pH 4.8、37℃條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate(PNPP)顯色底物產生1 μmol p-nitrophenol呈色物所需的酸性磷酸酶的量為一個酶活力單位(U)。以總蛋白濃度作對照，TRAP活性以TRAP比活力表示，按式(2)進行計算。

(1)

(2)

1.7 骨吸收陷窩的計數

骨片取出后，按1.3描述經1%甲苯胺藍染色后，100倍光鏡下計數整張骨片的吸收陷窩數。

1.8 統(tǒng)計學方法

數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件和Sigma Plot 10.0軟件處理，組間比較采用t檢驗，P< 0.05時認為差異顯著。

2 結果分析

2.1 MP-Ca的鑒定

制備的MP-Ca經純化后加入過量Na2S，生成了CaS沉淀和游離肽(顯色反應呈陽性)，說明鈣離子和肽結合形成了螯合物。在掃描電鏡下，MP與Ca2+螯合后，其疏松的片狀結構表面增加了顆粒性物質，類似于鹽的結構，這表明MP與鈣離子發(fā)生了螯合，形成了羧酸鹽和胺鹽。(見圖1)

2.2 破骨細胞鑒定

RAW264.7細胞加入RANKL培養(yǎng)24 h，光鏡下可見部分細胞開始融合，培養(yǎng)72 h出現了具有典型OC形態(tài)的細胞，可觀察到胞體較大，邊緣不整齊，周圍有刷狀緣(褶皺)，有偽足的細胞(圖2-左)，第5天觀察時視野中基本都是此類細胞。第6天部分細胞胞體縮小，第7天細胞數目明顯減少，細胞裂解。第3天檢測時，共培養(yǎng)的蓋玻片經TRAP染色可觀察到胞漿內形成棕紅色沉淀(圖2-中)；誘導培養(yǎng)至第5天，共培養(yǎng)的骨片經甲苯胺藍染色可觀察到清晰的吸收陷窩(圖2-右)。

綜上，破骨前體細胞RAW264.7培養(yǎng)4 h貼壁后，以50 ng/mL RANKL誘導培養(yǎng)96 h，分化形成具有典型細胞形態(tài)特征和骨吸收活性的成熟OC，所以第5天檢測到的細胞為成熟的OC。

2.3 細胞生長曲線

由圖3可以看出，第1天檢測時，誘導組和對照組的OD490值大致相同，兩組細胞都在第5天達到峰值，隨后直接進入凋亡期。第2天檢測時，對照組細胞直接進入對數期，而誘導組細胞的OD490值沒有升高。對數期內誘導組每個檢測點的OD490值均低于對照組。此結果與2.2中的形態(tài)學觀察結果吻合，所以在確定各受試物的最適作用濃度時，選擇第5天作為MTT法的檢測點。

圖1 MP(左)和MP-Ca(右)的掃描電鏡圖片(×2000)Figure 1 Scanning electron microscopic images of MP (left) and MP-Ca (right) (×2000)

圖2 RANKL誘導的RAW264.7細胞形態(tài)(左，×40)、TRAP染色結果(中，×100)及骨吸收陷窩(右，×100)Figure 2 Morphology (left, × 40), TRAP staining (middle, ×100) of RANKL-induced RAW264.7 cells, and pits formed in bone slice (right, ×100)

圖3 經RANKL誘導和未經RANKL誘導的RAW264.7細胞生長曲線Figure 3 Growth curves of RANKL-induced and non-induced RAW264.7 cells

2.4 MP和MP-Ca對OC誘導形成的影響

以不同濃度的受試物干預誘導過程，于第5天進行檢測，由圖4可知，隨著濃度的增加，MP、MP-Ca、E2組的OD490值總體呈下降趨勢，達到最低值后，OD490值保持相對穩(wěn)定，因此確定MP和MP-Ca的最適作用濃度為103μg/mL、17β-雌二醇為10 μg/mL。

圖4 各受試物的不同濃度對破骨細胞誘導形成的影響Figure 4 Effects of test substance concentration on the formation of RANKL-induced osteoclasts

在含等量RAW264.7細胞的誘導體系中添加最適作用濃度的受試物，MTT法測定并繪制細胞生長曲線，如圖5(A～C)所示，E2、MP和MP-Ca干預組的OD490起始值相同，但在第2～8天OD490值均低于空白組，說明各受試物對破骨前體細胞的誘導分化和增殖均有抑制作用。由圖5-D可知，各干預組第5天的OD490值均顯著低于空白組，且MP-Ca組顯著低于MP組，但顯著高于E2組(P< 0.05)。

2.5 MP和MP-Ca對TRAP活性和骨吸收陷窩數的影響

圖6中各干預組細胞裂解液中的TRAP活性均顯著低于空白組(P< 0.05)。E2組TRAP活性最低，MP-Ca組顯著低于MP組(P< 0.05)。各干預組的骨吸收陷窩形成數均顯著低于空白組(P< 0.05)，E2組陷窩數最少，MP組顯著低于MP-Ca組(P< 0.05)。

注：5-D中柱上方不同的字母表示各組之間差異有顯著性(P< 0.05)，圖6與此相同。圖5 MP、MP-Ca、E2干預組細胞的生長曲線(A～C)及第5天各組OD490值比較(D)Note. Different lower case letters above each column in 5-D indicate statistically significant differences (P< 0.05), The same as in Figure 6.Figure 5 Growth curves of MP-, MP-Ca-, and 17-β-estradiol-intervened RAW264.7 cells that were induced with RANKL (A-C) and comparisons of the OD490 of different groups on day 5 (D)

圖6 MP、MP-Ca、E2干預組細胞的TRAP活性和骨吸收陷窩數比較Figure 6 Comparison of TRAP activity and lacuna numbers formed in the MP-, MP-Ca-, and 17-β-estradiol-intervened groups

3 討論

肽與鈣結合可形成穩(wěn)定的肽鈣螯合物[9]。茚三酮化學反應法和電鏡觀察結果均表明MP與Ca2+發(fā)生了螯合，證明MP-Ca制備成功。MP-Ca既可滿足動物對氨基酸的需求，又可促進鈣的吸收[10]。

目前抑制骨吸收的藥物多為雙磷酸鹽類、激素類藥物及中藥等[11]。盡管許多研究證實了多肽鈣制劑對大鼠骨質疏松癥的防治效果[7,12]，但有關其對骨吸收抑制作用的研究，報道較少[13]。

TRAP被認為是破骨前體細胞向OC分化過程中產生的標志性酶，其活性高低能反映OC的分化程度[14]。融合形成的多核巨細胞雖然呈TRAP陽性，但不具有骨吸收活性，只有最后真正成熟的OC方具有骨吸收活性[15]。本研究在第2天觀察時個別細胞發(fā)生融合，第3天便可檢測到TRAP活性，但處于此分化階段的細胞沒有骨吸收活性，第4天開始，具有刷狀緣的成熟OC細胞數開始增多，第5天達到高峰并可檢測到骨吸收陷窩。

MTT法是檢測活細胞數目和細胞增殖情況的常用方法[16]。本研究表明最適濃度的受試物只減少破骨前體細胞分化過程中的活細胞數目，不改變生長曲線中峰值出現的時間，此結果與吳慶儒等[14]相同。本研究MTT法及TRAP活性檢測結果表明，相同最適作用濃度時，MP-Ca對OC誘導形成的抑制作用強于MP?；钴S的OC會分泌酸性物質和酶對礦化的骨基質進行分解吸收[17]，骨吸收陷窩的數量、大小和深度能直接反應OC的骨吸收能力[18]。MP及MP-Ca均能顯著減少骨吸收陷窩的數目，MP組陷窩數目顯著少于MP-Ca組，但單一的數目變化不足以說明OC骨吸收活性的變化，并不表明MP組的骨吸收活性一定低于MP-Ca組，除骨吸收數目外，還應考慮吸收陷窩的面積和深度。

綜上，在RAW264.7的RANKL誘導體系中，MP和MP-Ca均可抑制破骨前體細胞的增殖和分化，并抑制OC的骨吸收功能，并且MP-Ca對OC誘導形成的抑制作用強于MP，具體機制有待進一步研究。