張 雨，吳永梅，劉 敏，黃四洲*

(1.成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，成都 610500； 2.成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學教研室；四川省發(fā)育與再生四川省重點實驗室，成都 610500)

在胚胎發(fā)育中受精卵從單細胞到完整生命體，經(jīng)過了一個極其復雜而漫長的發(fā)育過程。在此過程中細胞進行細胞分裂的同時也在發(fā)生命運決定，細胞分裂和細胞分化各自相互獨立卻又互為偶聯(lián)[1]。Gem最早是在非洲爪蟾中被發(fā)現(xiàn)參與細胞周期中DNA復制調控[2]，隨后被發(fā)現(xiàn)分別參與了神經(jīng)[3-4]、眼睛[5]、血液[6]、癌癥等發(fā)生的調控，并被證明在調控細胞周期和細胞分化中起到了不可取代的作用[1,7]，這充分表明細胞周期因子不僅參與了細胞周期的精細調控，同時也作為一重要調控因子參與了胚胎發(fā)育的細胞命運決定過程。MCM5是DNA復制起始復合體中MCM2-7復合小體的重要因子，在幾乎所有真核生物細胞中都存在[8-9]，對DNA復制的起始和延伸起著重要的作用。MCM5在細胞中的數(shù)量極為豐富，其數(shù)量也遠遠超過了任何情況下起始DNA復制所必須[10]，這便暗示了MCM5可能擁有Gem相似的功能，參與到了細胞命運分化決定的過程中。部分報道表明MCM5參與了細胞命運的決定和組織器官的發(fā)育[7,11-12]，但這些都與細胞周期的停止和細胞凋亡相關[11]，而鮮有MCM5作為調控因子直接參與了胚胎各組織器官發(fā)育的特異性調控。

近年來，MCM5在部分研究中已被證實參與了基因轉錄調控，暗示MCM5可能會作為轉錄調控因子直接參與胚胎各組織器官的發(fā)育調控。運用染色質免疫共沉實驗分析復制起始位點與MCM5復合體數(shù)量關系時，發(fā)現(xiàn)在復制起始位點以外的地方存在許多MCM5結合的染色質位點[13]。這些位點可能與MCM5結合，調控特定基因的轉錄。在果蠅S2細胞中將MCM5量降低95%后，正常生存環(huán)境下S2細胞DNA復制和細胞周期進程仍不受影響[14]，這更提示MCM5可能還參與到基因轉錄調控中。另外，在大鼠成纖維細胞[15]及免疫細胞[16]中發(fā)現(xiàn)MCM5直接或間接參與基因轉錄調控；在細胞缺氧情況下MCM5與其他MCM家族成員形成轉錄抑制復合體，直接與HIF1結合而抑制HIF1的轉錄活性[17]。以上信息表明MCM5的確參與了基因轉錄調控，同時也暗示了在胚胎發(fā)育中MCM5可能通過特定基因的轉錄調控參與了組織器官的發(fā)育調控。MCM5少有被報道參與胚胎發(fā)育組織器官的發(fā)育調控，部分緣于在哺乳動物中重要細胞周期因子MCM5突變將導致胚胎在囊胚期死亡[18]。在斑馬魚中可以成功的將目的基因進行敲降并在體外實時觀察胚胎發(fā)育的情況，這為本課題組研究MCM5在胚胎發(fā)育中的功能提供了便利。

體節(jié)是沿胚胎前后軸空間順序形成一定數(shù)目的重復性結構，是軸旁中胚層(presomite mesoderm)細胞通過邊緣間充質細胞角質化(MET)以后形成的細胞團[19]，他們最后將形成骨骼、肌肉等組織。體節(jié)發(fā)生在不同模式動物中其分子調控機制存在一定的差異，但從形態(tài)發(fā)生上看，各個模式動物具有較高的共性。首先是軸旁中胚層的形成，然后沿體軸從前到后軸旁中胚層細胞以次周期性的形成體節(jié)，同時伴隨前后軸后端按照一定的速度向后生長延伸，以使新的PSM產(chǎn)生[19]。從機制上看分析，調控體節(jié)發(fā)生的細胞及分子調控機制在不同物種中存在高度的保守性：Notch及Wnt信號通路決定了體節(jié)發(fā)生的周期性及體節(jié)極性；而Fgf信號通路決定了體節(jié)發(fā)生的大小[20]。三者在胚胎發(fā)育早期共同調控了體節(jié)的正常發(fā)生。

本研究課題組運用原位雜交及MO敲降技術，發(fā)現(xiàn)MCM5參與了體節(jié)發(fā)生的調控。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型斑馬魚為AB品系。按照3R原則及動物喂養(yǎng)及使用倫理要求，斑馬魚在標準養(yǎng)殖條件下維持和喂養(yǎng)(28℃；pH=7.2)。

1.2 主要試劑

PCR purification Kit(D6492-01,Qiagen)；Reverse Transcription(#K1622,Thermo)；mMESSAGE mMACHINE(AM1340, Ambion)；Morpholino購自Gene Tools公司(mcm5MO：5-ATAGTTTCGATAAGT GCTGTCGATG-3；p53MO：5-GCGCCATTGCTTTGCAA GAATTG-3)；T4連接酶購自Invitrogen公司；Q5高保真酶、限制性內切酶購自NEB公司；原位雜交相關的試劑主要購自Roche公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胚胎注射

mcm5MO細胞注射：將MO從-80℃冰箱拿出后室溫下融化，放入65℃恒溫加熱5 min讓沉淀溶解，離心。吸取上清MO將其稀釋成工作濃度(300 umol/L)，在胚胎1～4細胞時期進行胚胎注射。

EGFPmRNA注射：將制備好的mRNA分裝，取出部分用RNase free水稀釋為30 ng/uL備用。胚胎在1～4細胞期注射注射卵黃。

1.3.2 整胚原位雜交

胚胎成長至所需時期，4%PFA固定24 h后剝膜過度到無水甲醇中脫水，于-20℃保存待用。原位雜交按照已報道方法進行[7]。

注：A-C：在10hpf(hours post fertilization)前mcm5廣泛表達于胚胎中所有細胞；D-F：在體節(jié)發(fā)生期，mcm5在頭部、尾牙、新生體節(jié)等處高表達；G：在第4天部分表達也與胸腺細胞特異重合(箭頭)。

1.3.3EGFPmRNA的合成及原位雜交RNA探針的合成

限制性內切酶將質粒DNA線性化，酶切過夜，用DNA快速純化回收試劑盒回收線性化DNA模板，用mMessagemMachine試劑盒體外轉錄合成mRNA；然后利用酚氯仿抽提回收mRNA，異丙醇沉淀。測定mRNA的濃度，分裝并放置于-80℃保存待用。

使用DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)試劑盒體外轉錄合成地高辛標記的原位雜交RNA探針，然后通過RNA純化試劑盒純化回收，檢測濃度并-20℃保存待用。

2 結果

2.1 mcm5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達模式

在研究mcm5在胚胎發(fā)育中的具體作用前，首先運用原位雜交方法檢測其在早期胚胎中的表達模式。研究發(fā)現(xiàn)mcm5是母源性表達因子，在胚胎發(fā)育2細胞及128細胞時呈高表達(圖1A，B)，在原腸運動及以前在胚胎中呈廣泛性表達(圖1A-C)。從體節(jié)發(fā)生早期開始表達出現(xiàn)特異性，從10體節(jié)開始mcm5在頭部、尾牙、側板中胚層及新生體節(jié)(箭頭)處等高表達(圖1D-F)。在第4天，mcm5被發(fā)現(xiàn)在胸腺等處集中表達(圖1G，箭頭所指)。以上數(shù)據(jù)表明mcm5在胚胎發(fā)育早期可能參與了體節(jié)發(fā)生的調控。

注：A：圖中所示為mcm5 CDs區(qū)域5′ 端部分非翻譯序列及MO設計序列。B-C：mcm5MO功能驗證。在EGFP序列上游添加一段與mcm5MO互為匹配的核酸序列，將整個序列克隆到pCS2+載體中(B)并制備EGFP mRNA。EGFP mRNA單獨注射EGFP. C：mRNA與mcm5MO共注射實驗顯示mcm5MO能很好的抑制EGFP mRNA的翻譯。

2.2 mcm5 MO的設計及功能驗證

為研究mcm5在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用，本課題組合成mcm5MO以特異的阻斷胚胎內源性mcm5 mRNA的翻譯(圖2A)。同時為了研究mcm5MO是否工作，本課題組構建了體外轉錄EGFPmRNA的載體(圖2B)。在該載體中于EGFP編碼區(qū)的上游添加了與mcm5MO完全匹配的DNA序列，這樣設計并體外轉錄所獲得的EGFPmRNA可以很好的與mcm5MO結合(圖2B)。理論上如果mcm5MO工作良好將會有效的抑制EGFP的翻譯，進而間接表明mcm5MO在體內能很好的抑制內源性mcm5 mRNA的翻譯。結果表明，當單獨注射EGFPmRNA時，在胚胎發(fā)育到第36小時仍然有較高量EGFP存在；而在共注射mcm5MO和EGFPmRNA的胚胎中，EGFP的量明顯降低(圖2C)。同時本課題組也發(fā)現(xiàn)，mcm5敲降的胚胎外觀上無明顯表型(圖2C)。以上實驗間接表明體外合成的mcm5MO能較好的抑制內源性mcm5mNA的翻譯。

注：A-C：mcm5調控了眼睛及體長的發(fā)育。與對照組相比，在注射mcm5MO后胚胎體軸變短(B)，眼睛變小(C，箭頭所示)。注射mcm5 mRNA回了mcm5MO注射所導致的表型(C)。D-E：mcm5MO注射并未導致心臟和血管發(fā)育的缺陷(紅色箭頭為血管；白色箭頭為心臟)。

注：A：與對照組胚胎相比，mcm5和p53功能敲降的胚胎體軸變短，眼睛變小。B-E：體節(jié)發(fā)生相關基因表達變化。Notch信號通路配體deltaD表達降低(B)，振蕩基因deltaC和her1表達降低(C，D)，體節(jié)極性基因mespb從兩條變成一條(E)。

2.3 mcm5參與了體節(jié)發(fā)生的調控

由于MCM5是DNA復制重要調控因子，MCM5功能敲降可能會導致細胞凋亡發(fā)生，從而影響MCM5功能敲降后表型的觀察。為研究MCM5功能敲降后胚胎特異性表型，本課題組在胚胎中共注射mcm5 MO及p53MO以敲降MCM5的功能，然后分析胚胎表型。結果發(fā)現(xiàn)，在胚胎共注射p53MO及mcm5MO后后，胚胎體軸變短且眼睛變小(圖3AB)，但胚胎無明顯外觀上的差異(圖3A)。進一步分析mcm5是否參與了心臟、血管等的發(fā)育調控。結果表明在mcm5功能敲降后心臟和血管的發(fā)育無明顯缺陷(圖3D-E)。為驗證mcm5MO功能敲降的特異性，分析是否mcm5 mRNA可以回救mcm5 MO注射所導致的眼睛變小、體軸變短的外觀缺陷。結果顯示mcm5 mRNA能較好的回救mcm5 MO注射所致的胚胎變短、眼睛變小的表型(圖3C)，表明mcm5 MO的特異性作用。

由于mcm5 mRNA在體節(jié)發(fā)生時于軸旁中胚層及新生體節(jié)中高表達(圖1)，暗示mcm5可能參與了體節(jié)發(fā)生的調控。活體胚觀察表明在mcm5功能敲降及對照組胚胎之間，體節(jié)形成無明顯的形態(tài)學差異(圖4A)。為進一步研究mcm5是否參與了體節(jié)發(fā)生，在MCM5功能敲降的胚胎發(fā)育到10體節(jié)左右本課題組運用原位雜交的方法分別檢查體節(jié)發(fā)生相關基因的表達(圖3B-E)。與對照組相比，Notch 信號通路配體deltaD，deltaC表達明顯降低(圖4B-C)，并且在已經(jīng)形成的體節(jié)中，deltaC的表達也明顯降低(圖4C 虛線半括號所示)，表明MCM5可能通過Notch信號通路參與體節(jié)發(fā)生。為進一步確認mcm5在體節(jié)發(fā)生中的作用，在mcm5功能敲降后分析振蕩基因her1及體節(jié)極性基因mespb的表達。與對照組相比，雖然her1的表達降低，但其振蕩表達模式并沒受到影響(圖4D)；但極性基因mespb表達明顯降低，表達模式改變(圖4E)。以上數(shù)據(jù)表明MCM5功能降低導致了Notch信號活性降低及體節(jié)極性缺陷。

3 討論

MCM5是DNA復制所必須的細胞周期因子，除調控細胞周期外，MCM5被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達，且被作為癌癥發(fā)生的標記基因。但是MCM5在胚胎發(fā)育中的作用鮮有報道。本研究通過研究mcm5在斑馬魚中的表達模式，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育早期mcm5于尾牙、軸旁中胚層及新生體節(jié)中表達，推測其可能參與了體節(jié)發(fā)生的調控。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在MCM5功能降低后雖然體節(jié)外觀上無明顯缺陷，但是體節(jié)標記性基因deltaD等表達受阻，且體節(jié)極性基因mespb從野生型中的2條變?yōu)?條，表明MCM5參與了體節(jié)發(fā)生的調控。

Notch信號通路是體節(jié)發(fā)生的重要調控因子，眾多Notch信號通路分子突變直接導致了體節(jié)震蕩基因deltaC、her1等的震蕩表達模式紊亂，同時使得體節(jié)發(fā)生缺陷。在MCM5功能降低時，本課題組雖然發(fā)現(xiàn)Notch信號通路deltaD表達降低，但是并未發(fā)現(xiàn)震蕩基因的震蕩表達模式變化，這暗示在體節(jié)發(fā)生過程中，震蕩基因的震蕩表達模式不僅僅受Notch信號通路調控，同時也說明Notch信號通路活性要降低到一定程度才可使得震蕩基因的震蕩表達模式受損。雖然MCM5功能降低后震蕩基因震蕩表達模式?jīng)]受影響，但體節(jié)極性基因mespb表達模式變化，說明mcm5以一種較為復雜的方式調控了體節(jié)的發(fā)生。在體節(jié)發(fā)生中mcm5以何種方式調控了Notch信號通路活性及體節(jié)極性，有待進一步研究。

本課題組以往研究表明在原腸運動時mcm5調控了中內胚層細胞間的剝離[7]，本研究又揭示了mcm5在體節(jié)發(fā)生中的作用，但mcm5在胚胎早期發(fā)生中的功能研究還遠未結束。從前言分析中可知MCM5在細胞中的表達量遠大于細胞周期中DNA復制所必須，作為轉錄調控因子的作用也被證明。本研究原位雜交實驗顯示mcm5 mRNA在尾牙、頭部等其他組織也搞表達，進一步說明mcm5可能還通過特定的方式參與了發(fā)育過程的其他活動。因此mcm5在體節(jié)發(fā)生及其他組織器官發(fā)育中的作用及機制有待進一步研究。