韓銀淑

(廈門醫(yī)學(xué)院，廈門 361023)

人類的表皮是非常重要的天然屏障，用來抵御環(huán)境中化學(xué)、物理和微生物的影響。位于真皮與表皮連接處的基底層分布有干細胞，它不斷的分化成新的角質(zhì)形成細胞(keratinocytes, KC)以更新表皮，而這些角質(zhì)形成細胞在表層脫落的過程中分化、死亡。盡管表皮處于不斷更新的狀態(tài)，但隨著角質(zhì)形成細胞更新速率的下降，衰老即產(chǎn)生。衰老與諸如表皮變薄、彈性組織缺失、黑色素細胞損失與皮膚蒼白和透明度增加以及屏障功能降低相關(guān)。相反，角質(zhì)形成細胞過度活化會引起的表皮過度增生及炎癥細胞的浸潤導(dǎo)致的局部炎癥。如銀屑病，癌前期病變?nèi)绻饩€性角化病，原位癌如Bowen病，皮膚癌如基底細胞癌，鱗狀細胞癌。角質(zhì)形成細胞的分子機制和信號傳導(dǎo)途徑在很大程度上是未知的，本研究試圖通過基因調(diào)控的視角揭示參與人類表皮組織衰老的分子機制與信號通路。

miRNA是內(nèi)源性22個核苷酸的小非編碼RNA，其通過靶向mRNAs并觸發(fā)翻譯抑制或RNA降解來控制基因表達[1]。這些非編碼RNA與靶mRNA的3’端結(jié)合，其結(jié)合的特異性主要由miRNA的啟動區(qū)域(從核苷酸2～8位)決定。通常情況下miRNA可同時調(diào)控數(shù)百個相同途徑的靶基因，并且為了增加這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，幾種miRNA可以靶向相同的轉(zhuǎn)錄物[2]。miRNAs是生物過程所必需的[3-4]。許多miRNA以組織特異性方式表達[5]。在橫紋肌中，miRNA參與其生理過程，如肌形成、纖維類型轉(zhuǎn)換和再生[6-8]。因此，miRNA表達水平的失調(diào)與病理狀態(tài)有關(guān)[9-10]。例如，SOD1G93 A轉(zhuǎn)基因小鼠中miRNA-206的抑制誘導(dǎo)嚴(yán)重萎縮[11]。然而，miRNA在人類表皮組織中的參與情況和所調(diào)控的信號通路很大程度上是未知的。

為了確定哪些miRNA和其調(diào)控的信號通路與表皮組織衰老過程相關(guān)，本課題組選擇了年輕人和老年人的表皮組織GEO芯片，檢查不同年齡下miRNA表達的差異，通過Cytoscape軟件(v.3.5.1)預(yù)測分析下游靶基因并篩選出關(guān)鍵基因分析其參與的細胞活動和參與的信號通路。總之，這些結(jié)果在一定程度上提示與衰老相關(guān)的miRNA在表皮細胞衰老過程中潛在的調(diào)控作用，為進一步治療和抵抗衰老提供新的理論依據(jù)和方法。

1 材料和方法

1.1 微陣列芯片分析

本研究使用二種芯片，包括基因芯片、miRNA芯片。使用GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析芯片數(shù)據(jù)。在所有實驗組中，差異表達的基因，miRNA均通過顯著性水平P< 0.05或|logFC| > 1來鑒定。

1.2 功能富集分析

可視化集成數(shù)據(jù)庫v.6.8(DAVID v.6.8)用來進行基因注釋?！熬┒蓟蚝突蚪M百科全書”(KEGG)和基因本體論(GO)用來對基因進行生物功能及通路分析。GO分析僅限用于生物過程分析。Cytoscape(v.3.5.1)平臺上的ClueGO和CluePedia插件用于可視化分析。GO術(shù)語基于共享基因的功能性進行連接，并根據(jù)功能相似性進行分組。

1.3 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)和分析

關(guān)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)的信息來源于檢索相互作用的基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索工具(https://string-db.org/)。選擇經(jīng)實驗驗證，并且得分≥0.4的基因。關(guān)于miRNA基因相互作用的信息是使用Cytoscape上相互作用的miRNA基因的檢索工具(v.3.5.1)推導(dǎo)。

2 結(jié)果

2.1 通過生物信息學(xué)分析鑒定了年輕與老年表皮組織micRNA芯片

使用GEO2R方法的GEO數(shù)據(jù)庫篩選老年(55～66歲)和年輕人(20～25歲)角質(zhì)形成細胞中差異表達的miRNA的分層聚類基因芯片(GSE101493)。結(jié)果顯示11個miRNA上調(diào)，18個miRNA下調(diào)(表1)。

2.2 通過生物信息學(xué)分析鑒定年齡差異的基因芯片

使用GEO2R方法的GEO數(shù)據(jù)庫篩選來自年輕人和老年人的表皮組織差異表達基因芯片(GSE18876)。篩查結(jié)果顯示，基于倍數(shù)變化(FC)或P值(| logFC |> 0.8或P< 0.05)，不同年齡表皮組織基因芯片中有105個差異表達基因。其中，有17個年齡相關(guān)基因共同上調(diào)，17個年齡相關(guān)基因共同下調(diào)。使用火山圖來顯示二種微陣列上所有基因的差異(圖1)。

2.3 年齡差異的miRNA與年齡差異基因的相互作用

為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，使用Cytoscape軟件(v.3.5.1)，選擇了差異最大的前5個上調(diào)的miRNA和前5個下調(diào)的miRNA，預(yù)測與它們相互作用基因。然后篩選了與基因芯片共表達的基因，為基因芯片中上調(diào)的基因與下調(diào)的miRNA預(yù)測的基因以及下調(diào)的基因與上調(diào)的miRNA預(yù)測基因的交集(圖3)。選擇差異最大的前5個下調(diào)的miRNA和前5個上調(diào)的miRNA用于互作網(wǎng)絡(luò)分析(圖4)。上調(diào)的miRNA預(yù)測靶基因與差異基因(下調(diào))交集，如表2顯示，GO分析的結(jié)果為這些差異基因主要與ω羥化酶P450途徑、NO生物合成過程、氧化還原酶活性、芳香化酶活性、凋亡過程的正調(diào)控、氧結(jié)合、細胞增殖負調(diào)控等相關(guān)。下調(diào)的miRNA預(yù)測靶基因與差異基因(上調(diào))交集，GO分析的結(jié)果顯示與細胞成分運動的調(diào)節(jié)、凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化、細胞或亞細胞的運動、程序性細胞死亡等功能相關(guān)，見表3。

表1 上、下調(diào)差異表達的miRNA在年輕與老年表皮組織中的表達差異

表2 差異基因的功能富集分析(下調(diào)基因)

注：18個下調(diào)的基因參與的生物學(xué)進程。Note. Enrichment biological process analysis of 18 down-regulated genes.

注：A：由無監(jiān)督聚類產(chǎn)生的熱圖，其將樣品分成年輕人和老年人。B：兩個芯片所有基因的火山圖。

注：A：下調(diào)的micRNA與基因芯片中上調(diào)基因的交集。B：上調(diào)的micRNA和基因芯片中下調(diào)基因的交集。

2.4 核心基因相互作用和通路富集分析

將共表達的基因使用在線蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測軟件(https://string-db.org/)篩選核心基因。隨后，使用DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫對篩選的核心基因進行KEGG通路分析。保留P< 0.05的通路用于PPI作圖。下調(diào)miRNA調(diào)控靶基因KEGG途徑富集分析結(jié)果顯示，該基因主要富集在局灶性粘連、PI3K/AKT信號通路、mTOR信號通路、蛋白質(zhì)多糖的代謝通路。上調(diào)miRNA調(diào)控靶基因KEGG途徑富集分析PPAR信號通路、趨化因子信號通路、PI3K/AKT信號通路、色氨酸代謝通路等。

表3 差異基因的功能富集分析(上升基因)

注：11個上調(diào)基因參與的生物學(xué)進程。Note. Enrichment biological process analysis of 11 up-regulated genes.

注：A：18個下調(diào)基因的KEGG通路分析。B：11個上調(diào)基因的KEGG通路分析。

3 討論

這些發(fā)現(xiàn)表明，microRNA參與了人類表皮衰老的微調(diào)。最近的研究結(jié)果表明，miRNA作為一種新型基因表達調(diào)控因子在銀屑病中發(fā)揮重要作用[12]。miRNA的成熟涉及多個步驟，此過程中依次生成兩種中間形式的miRNA，即原代(pri)和前體(前)miRNA。同時，RNase III酶Drosha和配偶雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合蛋白Dgcr8切割pri-miRNAs，其被Exportin5識別并隨后從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)的發(fā)夾形前pre-miRNA。另一個RNase III酶Dicer切割pre-miRNA以釋放22nt核苷酸(nt)dsRNA雙鏈體，即具有2nt 3’突出端的miRNA / miRNA雙鏈體。miRNA雙鏈中的一條鏈保存在RISC復(fù)合物中，另一條鏈則排出復(fù)合物外并迅速降解[13]。關(guān)于銀屑病皮膚中異常表達的小ncRNAs(sncRNAs)的研究結(jié)果提示sncRNA在牛皮癬中的功能作用[12]，大量實驗結(jié)果顯示在皮膚早期發(fā)育中占重要部分的miRNA也可以在銀屑病中以關(guān)鍵的方式起作用。這與“生命早期出現(xiàn)錯誤可能會在生命后期再次出現(xiàn)錯誤”的理念是一致的。

為了解這些miRNA控制的機制，本課題組同時篩選了不同年齡表皮的mRNA表達譜。在與差異的miRNA預(yù)測的基因取交集之后，研究結(jié)果顯示上調(diào)的miRNA調(diào)控的靶基因主要與細胞運動功能的調(diào)節(jié)、細胞凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化、細胞程序性死亡、有機氮化合物生物合成過程、RNA代謝過程的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、大分子代謝調(diào)控等。下調(diào)的miRNA調(diào)控的靶基因主要與ω羥化酶P450途徑、(NO)生物合成過程、氧化還原酶活性、芳香化酶活性、凋亡過程的正調(diào)控、氧結(jié)合、細胞增殖負調(diào)控等相關(guān)。特別值得注意的是上述信號通路往往是腫瘤組織異常激活的通路。上述結(jié)果提示衰老與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有共同的信號通路參與。上調(diào)miRNA調(diào)控靶基因KEGG途徑富集分析結(jié)果顯示其主要富集在局灶性粘連、PI3K/AKT信號通路、mTOR信號通路、蛋白質(zhì)多糖的代謝通路。上調(diào)miRNA調(diào)控靶基因KEGG途徑富集分析PPAR信號通路、趨化因子信號通路、PI3K/AKT信號通路、色氨酸代謝通路等。值得注意的是，上調(diào)與下調(diào)miRNA調(diào)控的靶基因均對PI3K/AKT信號通路具有調(diào)控作用，同時mTOR信號通路、PPAR信號通路、趨化因子信號通路均在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重點作用。這在某種程度上解釋了皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展病因。

目前在人類表皮衰老領(lǐng)域的miRNA研究較少，二代測序在鑒定miRNA并分析其在皮膚形態(tài)發(fā)生和體內(nèi)平衡中的特定功能方面取得了重大進展。此研究從基因水平和miRNA水平多維度確定了參與并調(diào)控衰老的潛在原因，所預(yù)測的結(jié)果為衰老疾病的治療和預(yù)測以及皮膚腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的機制研究提供了理論依據(jù)。