歐陽一鳴，凌 平，李臨海，龍亞新，朱 宇，王文榮

(云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650000)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的主要病理改變?yōu)轲つは袤w萎縮、變薄、炎癥，可伴有腸腺上皮化生及不典型增生。發(fā)病率占全部慢性胃炎的10%～20%[1]，世界衛(wèi)生組織已將其列為胃癌前狀態(tài)[2]。

鐵皮石斛是一種名貴中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰“主傷中；除痹，下氣；補(bǔ)五臟虛勞贏，強(qiáng)陰，久服厚腸胃”，可滋陰益胃、清熱生津。鐵皮石斛含有多糖、黃酮、生物堿等成分。研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用[3]。在對(duì)主藥為鐵皮石斛的鐵皮楓斗晶的研究中發(fā)現(xiàn)，該藥能促進(jìn)大鼠分泌胃液，增加胃酸、胃蛋白酶的排出量[4]。本研究使用鐵皮石斛多糖干預(yù)慢性萎縮性胃炎模型大鼠，旨在初步探討鐵皮石斛中的多糖成分所起到的作用及其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠120只，5～6周齡，雌雄各半，體重160～180 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK-(滬)2017-0008]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于云南省第一人民醫(yī)院屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[SYXK(滇)2014-0017]，每12 h明暗交替，福利倫理審查編號(hào)：20160512。

1.2 主要試劑與儀器

鐵皮石斛粗多糖高劑量：生藥含量為0.5 g/mL；鐵皮石斛粗多糖中劑量：生藥含量為0.25 g/mL；鐵皮石斛粗多糖低劑量：生藥含量為0.125 g/mL，以上藥物均由云南省第一人民醫(yī)院中藥房提供。養(yǎng)胃舒：每袋10 g(合肥神鹿雙鶴藥業(yè)有限公司)。

甲醛溶液(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；MNNG(上海藍(lán)季生物公司)；ELISA試劑盒(上海美旋生物技術(shù)公司)；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)。

RM2235病理切片機(jī)、EG1150C生物組織冷凍機(jī)、EG1150H生物組織包埋機(jī)(德國萊卡公司)； BX41OLYMPUS顯微鏡、Nikon ECLIPSE Ti 顯微攝像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)； PCR儀(美國ABI Veriti)；熒光定量PCR儀(美國ABI StepOnePlus)；核算蛋白質(zhì)定量?jī)x(美國ThermoNanoDrop 2000)；Bio-rad電轉(zhuǎn)槽(美國BIO-RAD公司)；電泳槽(上海天能科技有限公司)；37℃恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermoscientific公司)。

表1 PCNA、TNF-α基因的引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及模型的建立

120只大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為正常組、模型組、鐵皮石斛多糖高劑量組、鐵皮石斛多糖中劑量組、鐵皮石斛多糖低劑量組、養(yǎng)胃舒組，每組20只。模型組、鐵皮石斛多糖高劑量組、鐵皮石斛多糖中劑量組、鐵皮石斛多糖低劑量組、養(yǎng)胃舒組，給予167 μg/mL MNNG飲用液(裝入500 mL黑色水瓶中，自由飲用)，正常組自由飲用蒸餾水，造模8周。在病理組織學(xué)檢查確定造模成功后，根據(jù)參考文獻(xiàn)給藥[5]，鐵皮石斛多糖高劑量組每日灌胃給予鐵皮石斛多糖提取物生藥量1.34 g/kg；中劑量組0.67 g/kg；低劑量組0.335 g/kg。養(yǎng)胃舒組每日灌胃給予養(yǎng)胃舒顆粒4.0 g/kg。模型組給予生理鹽水灌胃。正常組不予干預(yù)。給藥12周后，對(duì)6組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，取出胃組織，固定并浸泡在福爾馬林中保存。

1.3.2 病理組織學(xué)檢查

光鏡觀察：①胃黏膜炎癥情況：采用半定量法[6]；②胃黏膜腺體厚度：隨機(jī)選擇胃竇部黏膜5個(gè)視野，測(cè)出每個(gè)視野下胃竇黏膜腺體厚度，取其平均值(μm)；③胃黏膜腺體數(shù)：100倍鏡下，找到胃竇的腺體數(shù)，以“個(gè)/毫米”為單位；④主細(xì)胞、壁細(xì)胞數(shù)：400倍鏡取5個(gè)視野平均值。

石蠟包埋，切片，采用HE染色法進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.3.3 血清GAS、IL-6的檢測(cè)

參照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.4 PCNA、TNF-α mRNA的檢測(cè)(RT-qPCR檢測(cè))

RNA提?。哼x取總RNA提取試劑提取總RNA。采用IPP 6.0圖像分析軟件測(cè)定PCNA、TNF-α mRNA。引物序列見表1。

1.3.5 Western Blot法檢測(cè)JAK2、STAT3、p-STAT3的表達(dá)

①蛋白樣品提??；②BCA蛋白定量；③制樣；④配分離膠；⑤配濃縮膠；⑥上樣；⑦電泳；⑧轉(zhuǎn)膜；⑨封閉；⑩孵育一抗；孵育二抗；采用IPP 6.0分析處理影像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重變化

正常組，鐵皮石斛多糖高、中、低劑量組、養(yǎng)胃舒組的體重均高于模型組(P< 0.05)。鐵皮石斛多糖高、中劑量組體重高于養(yǎng)胃舒組(P< 0.05)。(見表2)

2.2 病理學(xué)觀察

模型組炎癥等級(jí)高于正常組(P< 0.01)，而腺體數(shù)量、腺體厚度、主細(xì)胞數(shù)量、壁細(xì)胞數(shù)量低于模型組(P< 0.05)。鐵皮石斛多糖高、中、低劑量組，養(yǎng)胃舒組的炎癥等級(jí)、腺體數(shù)量、腺體厚度、主細(xì)胞數(shù)量、壁細(xì)胞數(shù)量較模型組均有恢復(fù)(P< 0.05)。與養(yǎng)胃舒組比較，鐵皮石斛多糖高、中劑量組的主細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)(P< 0.05)；鐵皮石斛多糖高劑量組的壁細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)(P< 0.05)。(表3)

正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，腺上皮與腺管間分界清楚，固有層偶見淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞；模型組大鼠胃體部和胃竇部粘膜可見一定量的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，部分粘膜肌層下見淋巴細(xì)胞灶，炎癥評(píng)分較高；鐵皮石斛多糖高劑量組大鼠胃竇部粘膜可見散在的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，部分粘膜肌層下偶見淋巴細(xì)胞灶，炎癥評(píng)分略高于正常組，但低于模型組；鐵皮石斛多糖中劑量組大鼠胃竇部粘膜可見一定量的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，炎癥評(píng)分略高于鐵皮石斛多糖高劑量組；鐵皮石斛多糖低劑量組大鼠胃竇部粘膜可見一定量的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，偶見淋巴細(xì)胞灶，炎癥評(píng)分高于鐵皮石斛多糖中劑量組，與養(yǎng)胃舒組相近；養(yǎng)胃舒組大鼠胃竇部粘膜可見一定量的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，粘膜肌層下偶見淋巴細(xì)胞灶。(表3、圖1)

2.3 血清GAS、IL-6含量檢測(cè)

正常組，鐵皮石斛多糖高、中、低劑量組，養(yǎng)胃舒組的GAS含量高于模型組(P< 0.05)。正常組，鐵皮石斛多糖高劑量組的IL-6含量低于模型組(P< 0.05)。(見表4)

表2 各組對(duì)CAG大鼠治療12周大鼠體重療效

注:與正常組比較，aP< 0.01，aaP < 0.01；與模型組比較，bP< 0.05，bbP < 0.01；與養(yǎng)胃舒組比較，cP< 0.05。下表同。Note. Compared with the normal group，aP< 0.01，aaP< 0.01. Compared with the model group，bP< 0.05，bbP< 0.01. Compared with the Yangweishu group，cP< 0.05.The same in the following tables.

表3 各組對(duì)CAG大鼠治療12周大鼠胃組織萎縮病理觀察

表4 各組對(duì)CAG大鼠治療12周大鼠血清GAS、IL-6含量

表5 治療12周大鼠胃組織PCNA、TNF-α mRNA基因的表達(dá)

表6 治療12周大鼠胃組織JAK2/β-actin、p-STAT3/STAT3的表達(dá)

注：A：正常組；B：模型組；C：鐵皮石斛多糖高劑量組；D：鐵皮石斛多糖中劑量組；E：鐵皮石斛多糖低劑量組；：F養(yǎng)胃舒組。

注：A：正常組；B：模型組；C：鐵皮石斛多糖高劑量組；D：鐵皮石斛多糖中劑量組；E：鐵皮石斛多糖低劑量組；F：養(yǎng)胃舒組。

2.4 胃組織中PCNA、TNF-α mRNA的表達(dá)

正常組，鐵皮石斛多糖高、中劑量組的PCNA、TNF-α mRNA低于模型組(P< 0.05)。(見表5)

2.5 胃組織中JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白的表達(dá)

正常組，鐵皮石斛多糖高、中劑量組JAK2、p-STAT3/STAT3的表達(dá)均低于模型組(P< 0.05)。(見表6、圖2)

3 討論

CAG的成因被認(rèn)為是由多因素綜合作用的結(jié)果，膽汁返流、飲食、藥物等是其主要影響因素[7]。從正常胃黏膜到發(fā)生癌變，需要經(jīng)歷慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生及異型增生等癌前階段[8]。CAG的治療，西醫(yī)常對(duì)癥處理，長(zhǎng)期療效欠佳，而中醫(yī)以補(bǔ)益脾胃為主，療效較好。我國中藥資源豐富，治療CAG的中藥也是舉不勝數(shù)，而石斛是其中的典型代表。石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效[9]。《本草求真》記載石斛“入脾腎，甘淡微苦、咸平，故能入脾，除虛熱”[10]。有研究認(rèn)為石斛能改善CAG大鼠的胃黏膜血流量，提高其屏障功能、抑制炎癥[11]。

PCNA是僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，密切反映細(xì)胞增殖的變化，其高表達(dá)表明細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)。TNF-α是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，也是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、代謝過程的多功能性細(xì)胞因子。JAK2/STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞增殖調(diào)亡有關(guān)，細(xì)胞因子與其受體接觸后，激活JAK2，JAK2刺激STAT3形成p-STAT3，進(jìn)入到細(xì)胞核?；罨腟TAT3可誘導(dǎo)PCNA、TNF-α的表達(dá)，推動(dòng)胃癌的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)表明鐵皮石斛多糖對(duì)CAG模型大鼠具有良好的保護(hù)及逆轉(zhuǎn)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制STAT3上游蛋白激酶JAK2活化從而抑制STAT3的活化。同時(shí)，下調(diào)PCNA、TNF-α基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞増殖，以此改善CAG模型大鼠的病理狀態(tài)。

綜上所述，本研究初步探討了鐵皮石斛多糖的應(yīng)用價(jià)值，也為CAG治療提供了廣闊的空間和方法。下一步，本課題組將尋找是否存在其他的作用通路，以期較為全面深入的探索其作用機(jī)制，為相關(guān)研究提供更多的數(shù)據(jù)支持。