劉 芬，關(guān)鳳英，張大威，呂文偉

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 長春 130021)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“鎮(zhèn)痛藥的藥效學(xué)觀察”為吉林大學(xué)藥理學(xué)有關(guān)中樞系統(tǒng)藥物的唯一經(jīng)典驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，是醫(yī)學(xué)“5+3”一體化、五年制及印尼留學(xué)生必做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。內(nèi)容包括鎮(zhèn)痛藥篩選的兩種經(jīng)典疼痛模型：熱板法和扭體法[1]。小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)是通過熱刺激引起軀體體表疼痛，原教學(xué)實(shí)驗(yàn)用于對比阿片類鎮(zhèn)痛藥哌替啶(杜冷丁)及芬太尼的鎮(zhèn)痛作用特點(diǎn)；小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)是通過化學(xué)刺激引起內(nèi)臟痛，原教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為“氯丙嗪加強(qiáng)哌替啶鎮(zhèn)痛作用觀察”觀察中樞抑制藥對鎮(zhèn)痛劑的協(xié)同作用。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)子項(xiàng)目使用的鎮(zhèn)痛藥物哌替啶和芬太尼均為阿片受體激動(dòng)劑，鎮(zhèn)痛效果明顯，具有實(shí)驗(yàn)效果的直觀性及實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)的緊湊性，兩者僅有作用強(qiáng)度及時(shí)程的差別，學(xué)生普遍反映良好。但最近幾年由于鎮(zhèn)痛、麻醉藥物的嚴(yán)格管制，出現(xiàn)哌替啶和芬太尼購買困難、且?guī)齑嫠幬镫y以維持教學(xué)使用的情況，故尋求臨床常用的非管制類且適合課堂教學(xué)節(jié)奏的鎮(zhèn)痛劑迫在眉睫。本項(xiàng)目擬摸索新的非管制類鎮(zhèn)痛藥物，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容改良，以適應(yīng)教學(xué)需求。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR雄性小鼠25只，7周齡，體重18～22 g，清潔級(jí)ICR雌性小鼠75只，7周齡，體重18～22 g，均購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(吉)2013-0001][SYXK(吉)2013-0005]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和處理嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利3R原則和吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)相關(guān)條例要求。

1.2 主要試劑與儀器

美洛昔康注射液勃林格殷格翰生產(chǎn)，批號(hào)：227355；精氨酸阿司匹林海南美康制藥有限公司，批號(hào):140703；鹽酸哌替啶注射液青海制藥廠股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20050407；安痛定注射液山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):1305050；冰醋酸北京北化精細(xì)化學(xué)品責(zé)任有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20030419；氯化鈉注射液遼寧民康制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：A110608。

YLS-6智能熱板儀，山東省醫(yī)學(xué)院設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥劑量

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均分成生理鹽水對照組(Control，0.1 mL/10 g)、美洛昔康組(Meloxicam，5 mg/kg)、阿司匹林組(Asipirin，0.6 g/kg)、安痛定組(Antodine，2.5 mL/kg)、哌替啶組(Pethidine，5 mg/kg)。給藥方式均為腹腔注射。

1.3.2 扭體法

每組小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。各組注射藥物20 min后，給予1%冰醋酸，復(fù)制腹痛的病理模型，觀察記錄15 min內(nèi)的扭體次數(shù)。匯總實(shí)驗(yàn)結(jié)果，算出各組扭體次數(shù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行受試藥組與對照組均數(shù)的比較，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并按下列公式計(jì)算抑制率：抑制率=(給藥組平均扭體次數(shù)-對照組平均扭體次數(shù))/對照組平均扭體次數(shù)×100%。

1.3.3 熱板法

將小鼠熱板儀調(diào)至(55±0.5)℃，測定小鼠正常痛閾值(即痛閾反應(yīng)時(shí)間)。篩選動(dòng)物：以舔后足為驗(yàn)證方法，將跳躍以及反應(yīng)時(shí)間﹤5 s或﹥30 s者剔除，同時(shí)記錄痛閾值。每組取預(yù)選合格雌性小鼠10只，并分組、給藥，給藥后分別于第15、30、45、60分鐘測定各個(gè)小鼠的痛閾值。如小鼠在60 s內(nèi)均無疼痛反應(yīng)，應(yīng)立即取出，按60 s計(jì)算，同時(shí)記錄痛閾值。匯總實(shí)驗(yàn)結(jié)果，算出各組用藥前后各次的小鼠痛疼反應(yīng)時(shí)間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行受試藥組與對照組均數(shù)的比較，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并按下列公式用所測得的痛閾平均值計(jì)算痛閾提高百分率：痛閾提高百分率=(用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值×100%，獲得各組的痛閾提高百分率后，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，痛閾提高百分率為縱坐標(biāo)，繪出鎮(zhèn)痛作用時(shí)程曲線，以分析藥物的作用強(qiáng)度、作用開始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 扭體法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

扭體法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：美洛昔康、阿司匹林、安痛定及哌替啶各組的扭體次數(shù)均顯著低于對照組(P< 0.001)，提示這對炎性致痛各藥均有很好的鎮(zhèn)痛效果；而阿司匹林、安痛定及哌替啶扭體次數(shù)顯著低于美洛昔康組(P< 0.001)，說明阿司匹林、安痛定及哌替啶的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于美洛昔康；安痛定組的扭體次數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于阿司匹林及哌替啶組(P< 0.05)提示安痛定組的鎮(zhèn)痛效果最優(yōu)，可以取代哌替啶，見表1。

2.2 熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：美洛昔康與對照組痛閾值比較差異無顯著性，阿司匹林、安痛定及哌替啶各組的痛閾值均顯著高于對照組(P< 0.05,P< 0.01)，可持續(xù)45 min，提示除美洛昔康外，阿司匹林、安痛定及哌替啶針對熱板法的疼痛模型均有很好的鎮(zhèn)痛效果；與阿司匹林組的痛閾值相比，安痛定及哌替啶組的痛閾值顯著延長(P< 0.05,P< 0.01)，說明安痛定及哌替啶的鎮(zhèn)痛效果相近，優(yōu)于阿司匹林組。提示熱板法實(shí)驗(yàn)中安痛定及阿司匹林可取代哌替啶及芬太尼，表現(xiàn)為作用強(qiáng)度的差異，見表2。

2.3 痛閾時(shí)程曲線：

經(jīng)過計(jì)算得出各組小鼠痛閾提高百分率，并繪制時(shí)程曲線。從痛閾時(shí)程曲線觀察得知，針對于熱板法疼痛模型，美洛昔康無鎮(zhèn)痛作用，阿司匹林、安痛定及哌替啶各組維持時(shí)間相仿，但哌替啶組起效時(shí)間優(yōu)于阿司匹林及安痛定組，鎮(zhèn)痛效果哌替啶>安痛定>阿司匹林。見圖1。

3 討論

疼痛是機(jī)體受到傷害性刺激后產(chǎn)生的一種保護(hù)性反應(yīng)，目前，最常用的鎮(zhèn)痛藥是非甾體類抗炎藥(如復(fù)方阿司匹林、布洛芬等)和阿片類鎮(zhèn)痛藥(如哌替啶、芬太尼、嗎啡等)，雖然兩類藥物均有不同程度的鎮(zhèn)痛作用，但是作用機(jī)制和應(yīng)用指證以及不良反應(yīng)卻不相同[2-6]。如非甾體類抗炎藥是通過抑制炎性介質(zhì)前列腺素生物合成關(guān)鍵酶環(huán)氧酶(COX)而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛及抗炎作用，適應(yīng)于炎癥引起的慢性鈍痛，作用廣泛，但可產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)；阿片類鎮(zhèn)痛藥則通過激動(dòng)阿片受體阻斷痛覺傳導(dǎo)，適于嚴(yán)重外傷、尖銳的疼痛及癌癥引起的疼痛,

表1 扭體法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：與對照組相比，***P< 0.001；與美洛昔康組相比，###P< 0.001；與安痛定組相比，⊿P< 0.05。Note. Compared with control group,***P< 0.001. Compared with meloxicam group,###P< 0.001.Compared with antodine group,⊿P< 0.05.

圖1 美洛昔康、阿司匹林、安痛定及哌替啶鎮(zhèn)痛治療后的痛閾時(shí)程曲線

表2 熱板法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

組別Groups痛閾值(s)Threshold of Pain0 min15 min30 min45 min60 min對照組Control18.2±5.5018.2±6.2517.6±6.3916.5±6.0218.7±5.81美洛昔康組Meloxicam19.7±4.4716.3±5.7716.8±6.1816.9±5.3717.4±4.77阿司匹林組Aspirin20.0±5.7432.3±9.63*35.2±10.27**22.8±8.4120.5±8.33安痛定組Antodine19.2±3.1437.2±8.89**47.5±5.63**#27.4±11.16**20.6±9.75哌替啶組Pethidine19.0±3.4852.2±6.76**#49.3±9.00**#37.1±10.97**#27.5±6.61*

注：與對照組相比，*P< 0.05,**P< 0.01；與阿司匹林組相比，#P<0.05。Note. Compared with control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with aspirin group,#P<0.05.

鎮(zhèn)痛效果好，但阿片類藥物則有不同程度的成癮性，這使得它們在臨床上的應(yīng)用受到了很大的限制。鎮(zhèn)痛藥的篩選一般通過小鼠熱板實(shí)驗(yàn)和小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)兩種經(jīng)典的疼痛模型。小鼠熱板實(shí)驗(yàn)主要用于篩選中樞性鎮(zhèn)痛藥，小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)主要用于篩選外周鎮(zhèn)痛藥物，這兩種經(jīng)典模型也一直被本科生教學(xué)實(shí)驗(yàn)所采用。此實(shí)驗(yàn)效果穩(wěn)定，課堂節(jié)奏比較適合教學(xué)實(shí)驗(yàn)，很受學(xué)生們的好評(píng)。為了該經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的可持續(xù)性，本研究著手尋求可替代藥物。阿司匹林、安痛定(復(fù)方氨林巴比妥注射液)是臨床和生活中常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，阿司匹林以往是口服制劑，不適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)節(jié)奏，注射用精氨酸阿司匹林劑型為課堂實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了保障。安痛定是氨基比林、安替比林和巴比妥組成的復(fù)方制劑，對發(fā)熱時(shí)的頭痛、神經(jīng)痛、肌肉痛有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。美洛昔康是一種新型非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疼痛、創(chuàng)傷性疼痛、手術(shù)后疼痛的對癥治療。美洛昔康為COX2選擇性抑制劑，消化系統(tǒng)等不良反應(yīng)少,安全性提高，所以廣泛應(yīng)用于臨床[7-9]。研究結(jié)果證實(shí)：綜合熱板法和扭體法兩種疼痛模型實(shí)驗(yàn)，阿司匹林和美洛昔康雖同屬于非甾體解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，但是阿司匹林鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于美洛昔康，可能因?yàn)槊缆逦艨禐镃OX2選擇性抑制劑，安全性提高但是效果較溫和；在扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，安痛定的鎮(zhèn)痛效果與哌替啶類似，高于其他兩種非甾體抗炎藥物，原因?yàn)槠鋸?fù)方制劑中含有苯巴比妥，此為中樞鎮(zhèn)靜劑，能夠與氨基比林等鎮(zhèn)痛藥物合用發(fā)揮協(xié)同作用，因而可以提高其鎮(zhèn)痛效果，其可以替換氯丙嗪加強(qiáng)哌替啶鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)；原熱板實(shí)驗(yàn)采用的哌替啶與芬太尼的藥理作用與嗎啡基本相同，鎮(zhèn)痛作用弱于嗎啡，哌替啶效價(jià)強(qiáng)度為嗎啡的1/10～1/7，而芬太尼鎮(zhèn)痛效力為嗎啡的100倍[10]，故二者的實(shí)驗(yàn)效果體現(xiàn)為鎮(zhèn)痛效果有所差別，阿司匹林與安痛定實(shí)質(zhì)上同為非甾體抗炎藥，本熱板實(shí)驗(yàn)觀察到，二者亦表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效果的差別，故可替代哌替啶與芬太尼。綜上所述，鑒于哌替啶及芬太尼為管制性藥品，今后的學(xué)生實(shí)驗(yàn)可以選擇美洛昔康、精氨酸阿司匹林及安痛定進(jìn)行藥效強(qiáng)弱的對比及二藥合用的協(xié)同作用觀察的替代藥物。在扭體法中可選用美洛昔康與阿司匹林、安痛定進(jìn)行藥效強(qiáng)弱的對比；在熱板法可以選用阿司匹林及安痛定分別觀察藥物的作用強(qiáng)度、作用開始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。并同時(shí)在兩種模型中觀察安痛定組中樞抑制藥苯巴比妥對鎮(zhèn)痛劑的協(xié)同加強(qiáng)作用。