肖明理 毛露濤

（廣元市食品藥品檢驗檢測中心 四川 廣元 628000）

1.材料與方法

1.1 質(zhì)控盲樣

由中國食品藥品檢定研究院下發(fā)，共收到NIFDC-PT-135R的三份巧克力樣本，編號分別為0212、0018、0619，裝量約為10g，采用玻璃瓶包裝。

1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、革蘭氏染色儀、拍擊氏均質(zhì)器、全自動微生物鑒定系統(tǒng)、滅菌器、生物安全柜等。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基分別購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司和青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，試劑購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司,診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。所使用的培養(yǎng)基、試劑和診斷血清均在有效期內(nèi)，使用前都經(jīng)過了質(zhì)量控制[1]。

1.4 檢驗方法

GB4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》[2]。

2.實驗步驟

2.1 增菌培養(yǎng)

無菌操作在生物安全柜內(nèi)開啟玻璃瓶。準(zhǔn)備90ml預(yù)熱至45℃的滅菌BPW:首先取20ml滅菌BPW加入檢樣瓶內(nèi)，待巧克力樣品融化后加入無菌均質(zhì)袋內(nèi)。取20ml滅菌BPW清洗檢樣瓶，將洗液加入均質(zhì)袋內(nèi)，再取20ml滅菌BPW重復(fù)清洗一次，最后向均質(zhì)袋內(nèi)加入30ml滅菌BPW，充分均質(zhì)混勻，制成1:10稀釋液。依此方法，分別對3件樣品進行前處理。36℃分別靜置培養(yǎng)8小時和18小時。再將培養(yǎng)8h和18h后的BPW前增菌液分別混合后，分別移取1ml轉(zhuǎn)種于10mlTTB和10mlSC增菌液中進行培養(yǎng)（每種增菌液轉(zhuǎn)種5管）。同時在檢測過程中同步代入待檢菌陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115和陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌ATCC25922。

2.2 分離培養(yǎng)

分別用直徑3mm的接種環(huán)取上述增菌液劃線接種BS平板、XLD平板、HE平板、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，置36℃培養(yǎng)24h（BS平板48h）。

2.3 培養(yǎng)結(jié)果

3份盲樣標(biāo)本都在TTB增菌的直接接種的平板有良好生長，而SC增菌的直接接種的所有平板均無典型菌落生長，根據(jù)本次質(zhì)控考核樣本為沙門氏菌檢驗的提示，可從各個有典型菌落生長的平板里，每個平板挑取5個以上可疑菌落繼續(xù)進行培養(yǎng)和鑒定。各個盲樣標(biāo)本在平板上的生長情況見表1。

表1 3份盲樣菌種在典型培養(yǎng)基平皿中的生長情況

2.4 生化與染色

在上述平板上分別挑取5個以上不同的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂平板，置36℃培養(yǎng)24h，同時做革蘭氏染色。具體生化反應(yīng)見表2。

表2 可疑菌株生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)表2顯示，0619及0018號菌初步反應(yīng)符合沙門氏菌，并分別進行進一步生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗。

2.5 生化鑒定

挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上純培養(yǎng)物，制成0.6麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，用VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定，鑒定結(jié)果0619及0018號均為沙門氏菌，鑒定百分率 98%。

2.6 血清凝集試驗

挑取營養(yǎng)瓊脂上菌落做血清學(xué)試驗，A-F多價O血清強凝集；生理鹽水對照不凝集。

2.7 實驗結(jié)論

綜上所述，由生化和血清學(xué)試驗結(jié)果可知，本次盲樣考核0619及0018檢出沙門氏菌，0212未檢出沙門氏菌。

3.討論

本次盲樣考核是巧克力中沙門氏菌檢驗，采用BPW 8h和18h二次前增菌，每個增菌管接種五管，分別劃線四種不同培養(yǎng)基，挑取5個以上可疑菌落做生化和血清學(xué)分析，其目的避免漏檢。通過參加室間質(zhì)控考核，可以提高我們的檢測能力，特別是在食源性疾患及食物中毒等監(jiān)督抽檢中，可迅速準(zhǔn)確檢出目標(biāo)菌。

培養(yǎng)基的選擇也很重要，SC增菌培養(yǎng)基所轉(zhuǎn)種的平板均無可疑菌落生長，原因可能是增菌時間短及轉(zhuǎn)種操作技術(shù)不到位導(dǎo)致目標(biāo)菌漏檢[3]。今后在日常工作中，樣品中經(jīng)常含有其他雜菌，要從中分離出特定致病菌，應(yīng)盡可能的多選擇幾種增菌液，多選擇幾種分離平板，多劃線平板多挑幾個可疑菌落鑒定分析，這就需要檢驗人員嚴肅認真工作態(tài)度、精密細致的觀察和熟練的操作技能[4]。

總之，日常工作中就要做好實驗室的質(zhì)量控制工作，如培養(yǎng)基和診斷血清的驗收、儀器的保養(yǎng)和檢定、標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存與傳代、實驗環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)測并注重生物安全[5]。通過本次能力驗證，及時發(fā)現(xiàn)了工作中存在的問題并及時糾正，實驗室水平得到了提高和完善[6]。