王磊 時(shí)軍利 李炳慶

【摘 要】

目的：本研究探討大腸埃希菌在炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。方法：實(shí)驗(yàn)雄性小鼠（C57BL/6）24只按體重大小平均隨機(jī)分為兩組：A組：給予氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM）聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）制造炎癥相關(guān)小鼠結(jié)直腸癌模型，B組：AOM、DSS給藥方法同A組，其余時(shí)間飲用含大腸埃希菌的飲用水。均在第10周末處死小鼠，取得結(jié)直腸組織，計(jì)數(shù)腫瘤個(gè)數(shù)。結(jié)果：造模結(jié)束后A組中腫瘤計(jì)數(shù)總數(shù)為29，平均為2.90±2.183，B組總數(shù)為63，平均為9.00±3.555，兩組差異顯著（P<0.05）。A組成瘤率58.33%，B組成瘤率58.33%，病理均提示腺癌，兩組間成瘤率無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：大腸埃希菌在炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型中起促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)作用。

【關(guān)鍵詞】 炎癥性腸??；結(jié)直腸腫瘤；大腸埃希菌；腸道微生態(tài)

【中圖分類號(hào)】R365 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

B 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）14-024-01

E coli.promote tumorigenesis in a mouse model for colitis-associated cancer

Wang Lei，Shi Jun-li，Li Bing-qing

Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital Of Chengde Medical College， Chengde 067000， Heibei Provence， China

Correspondence to： Li Bing-Qing， M.D.professor， Chief，Department of Gastroenterology， The Affiliated Hospital Of Chengde Medical College， NO. 36 Nanyingzi street， Chengde city 067000， Heibei Provence，China. Libq68@sohu.com

This work was supported by Health Department of Hebei Province（NO.20150021）

Abstract：

Objective：Elevate the effection of E coli. for tumorigenesis in mouse model of colitis-associated colorectal cancer induced by azoxymethane （AOM） and dextran sulfate sodium salt（DSS）. Methods： 24 male mice were randomly divided into group A and group B according to weight. The mice in Group A received intraperitoneal administration of AOM（10mg/kg）for one time， then drunk freely 1.5-2.1% DSS at the first， fourth， seventh week for three circles， the left time drunk freely distilled water. The mice in Group B received AOM and DSS as the same as group A， then drunk water including E coli. for left time.All mice were killed at the end of the tenth week.Collected the colorectum from anus to the end of cecum， count the number of tumor. Results： The number of tumor is 29，and 2.90±2.183 averagely in group A， and 63 in total ， 9.00±3.555 averagely in group B.There is difference between the two groups（P<0.05） ， The tumor formation rate is no difference （P>0.05）， and 58.33% in group A， 58.33% in group B. Conclusion：E coli. promote tumorigenesis in mouse model for colitis-associated cancer.

Key words：Inflammatory bowel disease； Colorectal cancer；E coli.；Microbiota

前言

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，針對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究越來(lái)越深，從分子生物學(xué)到基因?qū)W，其發(fā)生機(jī)制逐步被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生相關(guān)因素包括遺傳 [1]、高牛肉飲食 [2]及炎癥性腸病 [3]等等。此外，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展還與腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)，有研究指出無(wú)菌環(huán)境中生長(zhǎng)的小鼠發(fā)生結(jié)直腸癌幾率增高，大腸埃希菌屬及具核梭菌屬含量在結(jié)腸癌組織中及結(jié)腸癌患者大便中的含量明顯高于正常結(jié)腸組織及正常人大便[4-5]。本實(shí)驗(yàn)探討大腸埃希菌在炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型中對(duì)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用小鼠為5-6周齡雄性C57BL/6小鼠（購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）24只，常規(guī)飼養(yǎng)一周，便于小鼠適應(yīng)生活環(huán)境，后給予鏈霉素（濃度2.5g/L）飲用3天。按體重大小平均隨機(jī)分為兩組，并按照之前報(bào)道的方法制造炎癥相關(guān)結(jié)直腸小鼠模型。簡(jiǎn)述如下：AOM（10mg/kg）腹腔注射1次，在第1周、第4周、第7周服用 1.5-2.1% DSS飲用水，其余時(shí)間自由服用清水。其中A組：于第10周末處死小鼠，留取全部結(jié)直腸組織，結(jié)腸組織粘膜面給予0.1%靛胭脂染色并計(jì)數(shù)腫瘤個(gè)數(shù)，組織進(jìn)行甲醛固定后，行病理HE染色。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠便血及存活情況。B組：小鼠除服用DSS飲用水外，其余時(shí)間飲用含大腸埃希菌的飲用水（大腸埃希菌于人大便中培養(yǎng)獲得），并每日灌胃含有大腸埃希菌飲用水1ml。飲用過(guò)程中每日清洗水瓶，并更換新的大腸埃希菌飲用水，第10周末處死小鼠，標(biāo)本處理同A組。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)論證。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料記錄采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)a=0.05。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

一般情況：腹腔注射AOM時(shí)B組死亡1只，第一周是服用DSS4天后兩組小鼠出現(xiàn)便血情況，第6天A組死亡1只，B組死亡2只。第7周B組死亡2只，第8周A組死亡1只，解剖后A組小鼠結(jié)腸內(nèi)未見(jiàn)腫瘤及出血，B組可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)。

兩組成瘤情況：A組 7只小鼠可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，成瘤率58.33%，病理提示為腺癌，B組7只小鼠均見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，成瘤率58.33%，兩組間成瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。A組中腫瘤計(jì)數(shù)總數(shù)為29，平均為2.90±2.183，B組總數(shù)為63，平均為9.00±3.555，兩組差異顯著（P<0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)由腫瘤導(dǎo)致死亡的原因之一，關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制已有相關(guān)可喜的研究報(bào)道，但具體的分子機(jī)制仍不十分清楚。結(jié)直腸癌的原因可能是多因素參與，例如遺傳、飲食、炎癥等，近期越來(lái)越多的研究提出其與腸道微生態(tài)密切相關(guān)。腸道菌群及其產(chǎn)物在維持腸道屏障功能、免疫、營(yíng)養(yǎng)等方面起到重要作用，這些產(chǎn)物包括：葉酸、B族維生素、短鏈脂肪酸等，而這些細(xì)菌及產(chǎn)物是構(gòu)成腸道微生態(tài)的主要因子。有研究指出腸道菌群的改變與炎癥性腸病相關(guān)，進(jìn)一步與結(jié)直腸癌相關(guān) [6]。腸道微生態(tài)的改變與結(jié)直腸癌相關(guān)，這是在結(jié)腸癌的腸道內(nèi)及腸道上皮中生存的腸道細(xì)菌與正常結(jié)腸不一樣。研究發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌的病人中糞便及腸道上皮定植菌中大腸埃希菌與具核梭桿菌增加。但并不能證明是菌群改變導(dǎo)致結(jié)腸癌，還是結(jié)腸癌發(fā)生引起菌群變化。目前并沒(méi)有證據(jù)支持具體哪個(gè)細(xì)菌是結(jié)直腸癌的致癌物 [7]。本實(shí)驗(yàn)從炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型層面探討大腸埃希菌對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響，得到的結(jié)果是服用含有大腸埃希菌的飲用水的B組小鼠發(fā)生結(jié)直腸腫瘤的個(gè)數(shù)多于A組。

上面提到結(jié)直腸癌的病因有很多，文章報(bào)道的有多種基因與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)，包括APC；IL-10、Myd88 [8]；TLR4等。同時(shí)也已有文章 [12]報(bào)道了雌激素可促進(jìn)結(jié)直腸癌的形成。Stani D.Day等報(bào)道了高脂肪飲食導(dǎo)致的結(jié)直腸癌可能由炎癥介導(dǎo)，本研究為探討大腸埃希菌是否影響小鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的影響，所以為剔除上述原因干擾。干預(yù)方法僅為含有大腸埃希菌的飲用水進(jìn)行灌胃及自由飲用，得到的結(jié)果提示大腸埃希菌促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)直腸癌的腸道微環(huán)境與正常腸道不同，其中包括腸道微生態(tài)。腸道微生態(tài)的改變影響著結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。APCmin/+小鼠的證實(shí)大腸埃希菌可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生，但并未觀察到明顯的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用野生型小鼠，制造炎癥性相關(guān)結(jié)直腸癌模型，在這種模型上我們給予大腸埃希菌干預(yù)，可進(jìn)一步破壞腸道微生態(tài)的平衡，模擬炎癥性腸病患者腸道情況，進(jìn)而得到的結(jié)果為B組腫瘤生長(zhǎng)的數(shù)量明顯多于A組，這也證實(shí)了在腸道微生態(tài)平衡破壞后大腸埃希菌數(shù)量的增加對(duì)結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)起到重要作用。有實(shí)驗(yàn)指出在結(jié)直腸癌中提取的大腸埃希菌11G5比在正常結(jié)腸組織中企圖的大腸埃希菌K-12對(duì)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)起到作用大，然而我們得到的結(jié)果是在人大便中提取的大腸埃希菌可導(dǎo)致更多的結(jié)直腸癌的發(fā)生，但在成瘤率上與A組無(wú)明顯差異，這和文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是這種作用是大腸埃希菌導(dǎo)致的還是其產(chǎn)物原因，尚需要進(jìn)一步研究。同時(shí)在我們的試驗(yàn)中我們觀察到A組結(jié)直腸癌組織中及其旁見(jiàn)到了大量的炎癥細(xì)胞聚集，這種現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道不一樣，是不是說(shuō)明大腸埃希菌促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)是通過(guò)炎癥途徑，尚需進(jìn)一步研究。

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