王麗飛 王東昌 閆振鋒 岳紅云 陳 剛

圖1 數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(international agency for research on cancer, IARC)統(tǒng)計，最新報道2012年數(shù)據(jù)，肺癌是危害人類健康與生命的第一位腫瘤，肺癌的5年患病人數(shù)為491 223[1]。多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期[2]，隨著高通量測序技術(shù)[3-4]的發(fā)展，為快速研究肺癌的基因表達(dá)譜的關(guān)鍵基因變化規(guī)律提供了良好的平臺，利用該項技術(shù)積極尋找該疾病的發(fā)病機(jī)制對于人類有極其重大意義。本研究主要通過對不同類型的癌細(xì)胞的基因進(jìn)行篩選，通過對差異基因的生物學(xué)功能及信號通路分析研究，探討差異基因之間的相互作用，為臨床提供更多的理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1.材料 生物信息分析數(shù)據(jù)GSE70540 ID：200070540，數(shù)據(jù)來自于NCBI(美國國立生物信息中心)公共數(shù)據(jù)平臺(gene expression omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)研究類型為Expression profiling by array，種屬為homo sapiens, 芯片平臺為GPL570。該芯片數(shù)據(jù)包括3例過表達(dá)超保守區(qū)的肺癌細(xì)胞A549，3例空載體轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞的陣列數(shù)據(jù)。

2.數(shù)據(jù)處理及差異基因分析 對原始數(shù)據(jù)集使用R軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過RMA算法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值進(jìn)行計算。差異基因的篩選需要滿足P<0.05及Log2≥1。

3.差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析 生物信息數(shù)據(jù)注釋數(shù)據(jù)庫(database for annotation, visualization and integrated discover, DAVID)是一個在線的(https://david.ncifcrf.gov/)生物信息分析的工具，可將大批基因及蛋白信息進(jìn)行綜合的生物信息功能注釋。通過將差異基因上傳后進(jìn)行腫瘤學(xué)富集(gene ontology, GO)[5]及通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)[6]分析。以P<0.05和FDR<0.05設(shè)置為具有顯著性基因富集的臨界值。

4. 差異基因的相互作用分析 應(yīng)用已知或預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)形成的數(shù)據(jù)庫STRING 10.0(Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins)[7]，它包括直接及間接的蛋白之間進(jìn)行相互作用的分析。最后使用Cytoscape軟件[8]構(gòu)建蛋白與蛋白之間相互作用(protein-protein interaction, PPI)的網(wǎng)絡(luò)分析,數(shù)據(jù)設(shè)置條件為評分>0.4。

結(jié) 果

1.對數(shù)據(jù)基本情況進(jìn)行評價 對下載數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制的要求是：①基因中位數(shù)值至少發(fā)生2倍的改變；②基因表達(dá)量的差異需要P<0.02；③.數(shù)據(jù)的缺失值不得<50%。該數(shù)據(jù)的標(biāo)本質(zhì)量控制顯示的RLE在同一水平線，RNA降解圖，權(quán)重圖、權(quán)重符號圖、殘差圖顯示圖像均勻，表明該檢測標(biāo)本的穩(wěn)定性及質(zhì)量均在較好的范圍，因此解析的數(shù)據(jù)具有可分析性(圖1)。

2. 對差異基因進(jìn)行篩選結(jié)果 通過對慢病毒過表達(dá)超超保守區(qū)399的A549細(xì)胞及空載體細(xì)胞進(jìn)行差異基因進(jìn)行篩選，共有230個差異表達(dá)基因(肺癌A549細(xì)胞)，其中上調(diào)基因217個，下調(diào)基因13個(圖2)，使用R語言將差異基因做熱圖(綠色代表低表達(dá)，紅色代表高表達(dá))。

圖2 差異基因熱圖分析

表1 過表達(dá)超保守區(qū)399后A549細(xì)胞的上調(diào)的基因GO分析

表2 過表達(dá)超保守區(qū)399后A549細(xì)胞的上調(diào)的基因KEGG通路分析

3.差異基因GO分析結(jié)果 使用DAVID網(wǎng)站對上調(diào)基因及下調(diào)基因進(jìn)行GO富集分析，分析結(jié)果顯示：上調(diào)的基因主要位于胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙，主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)方面的功能；下調(diào)的差異基因較少無法進(jìn)行GO分析。部分上調(diào)基因GO結(jié)果見表1。

4. KEGG信號通路分析 通過KEGG分析富集得到差異基因最顯著的上調(diào)的差異基因所在的信號通路。上調(diào)的主要在化學(xué)致癌、藥物代謝的細(xì)胞色素P450、視黃醇的代謝等通路上發(fā)揮作用，而下調(diào)的基因因個數(shù)較少無法進(jìn)行KEGG分析，部分上調(diào)基因KEGG通路見表2。

5.蛋白質(zhì)相互作用的模塊分析 蛋白相互作用依賴于STRING網(wǎng)站對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選得出最終結(jié)果，在其中篩選出居于前10位的核心基因的蛋白質(zhì)，主要是CFH、MUC5B、PTGS2、LRRK2等(圖3)。

圖3 差異蛋白相互作用示意圖

討 論

在腫瘤研究中心的機(jī)制探討過程中，有多種實驗方法。近年來生物芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用使得腫瘤研究擁有了一個更大平臺。生物芯片主要從基因的差異，基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與調(diào)控、表觀遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)修飾等不同方面，揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展及在參與過程提供了平臺[9]。因此我們可以在宏觀上定量分析的方式了解腫瘤發(fā)生發(fā)展中的基因水平變化，從而更有目的對腫瘤的基因進(jìn)行分析。在這些基因之上對腫瘤基因表達(dá)譜進(jìn)行收集整理，形成腫瘤表達(dá)譜，并對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的整理和分析。在此當(dāng)中挖掘有利于研究的信息及知識，因此來推進(jìn)腫瘤學(xué)的研究及臨床的防治策略。我們采用對GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析下載，對該芯片進(jìn)行檢測后，采用分子生物學(xué)研究方法、手段、聯(lián)合細(xì)胞水平的分析，取得相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果。

本研究是通過使用GEO平臺，對慢病毒轉(zhuǎn)染的高度超保守區(qū)399及空載體的A549細(xì)胞進(jìn)行差異基因進(jìn)行分析?；虻谋Ｊ匦蛄?conserved sequence)[10]是指具有高度相似性或同一性的分子序列，該序列包括核酸序列及蛋白質(zhì)序列。這些序列是來自不同物種的但是具有高的相似性的片段，在物種的進(jìn)化過程中保守下來。一些研究者認(rèn)為保守序列的基因區(qū)域若是發(fā)生突變可能導(dǎo)致生命體的死亡或者是淘汰。而高度超保守區(qū)的序列可能具有一定的功能價值。目前關(guān)于高度保守的片段研究還不清楚。

本研究通過對GEO的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在過表達(dá)超保守區(qū)后，出現(xiàn)了差異表達(dá)的基因，最終篩選出271個表達(dá)上調(diào)的基因及13個表達(dá)下調(diào)的基因。與正常肺腺癌相比上調(diào)基因主要有HLA-DMB、CORO2A、C4BPA、ST6GALNAC1、ANXA13、PRR15、CYTIP、ADH1C、PYCARDOS、SLC27A3、KIR2DS3等基因。

通過GO分析，該研究發(fā)現(xiàn)在上調(diào)的差異基因中主要涉及血管內(nèi)皮的調(diào)節(jié)、生長，補(bǔ)體的激活免疫系統(tǒng)，炎癥介質(zhì)的反應(yīng)等生物過程。血管內(nèi)皮的調(diào)節(jié)是一類與癌癥的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移有廣泛關(guān)系的因素。Goel等[11]研究證明, 血管內(nèi)皮生長因子不僅是在癌癥中促進(jìn)血管再生及增加血管的通透性，而且在腫瘤的發(fā)生上起到一定的促進(jìn)作用。Yamagishi等[12]研究證明, 生長因子可以提高結(jié)腸癌的惡性程度。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)超保守區(qū)后細(xì)胞內(nèi)存在差異基因并在該通路上進(jìn)行富集，因此我們可以推測在人肺腺癌中過表達(dá)的超保守區(qū)可以促進(jìn)癌癥的進(jìn)一步發(fā)展和惡化。

KEGG通路分析的結(jié)果表明，差異基因中的信號通路與化學(xué)致癌有一定的關(guān)系。化學(xué)致癌是DNA的雙鏈之間發(fā)生了互補(bǔ)堿基的移碼突變。與該機(jī)制相關(guān)的KEGG通路分析主要有7個相關(guān)的基因。目前關(guān)于化學(xué)致癌的研究已有一定的數(shù)據(jù)但其主要方向是關(guān)于化學(xué)致癌物的研究，如WTO的關(guān)于低劑量化學(xué)致癌物的相關(guān)研究報道[13]。關(guān)于其機(jī)制的研究目前較少，本研究數(shù)據(jù)在化學(xué)致癌相關(guān)的通路上進(jìn)行了一定的分析，可為未來化學(xué)致癌提供一定的方向。

綜上所述本研究通過使用多個基因分析的軟件進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的篩選、整合、挖掘機(jī)分析，探索了超保守區(qū)域過表達(dá)后對癌基因的影響。分析出相關(guān)的超保守區(qū)癌細(xì)胞過表達(dá)后差異基因，對其進(jìn)行GO、KEGG等分析推測出可能相關(guān)的基因和通路，為肺癌的超保守區(qū)提供研究思路和方向。