崔巖 李珊山 侯媛媛 宋洋 陳瑞麗 李洪霞

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科，長(zhǎng)春 130021)

黑素(melanin)是一種耐酸、耐熱、帶負(fù)電荷的疏水性大分子聚合物，是真菌重要的毒力因子之一，致密地覆蓋于細(xì)胞壁表面。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，黑素可通過(guò)抵御活性氧簇(ROS)、紫外線、重金屬離子的殺傷以及降低巨噬細(xì)胞的吞噬等多種途徑保護(hù)菌體，使之能在不利環(huán)境中生長(zhǎng)[1]。

球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa)可以通過(guò)1，8-二羥基萘(dihydroxynaphthalene，DHN)途徑、L-多巴(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)途徑和酪氨酸(L-tyrosine)途徑合成黑素。S.globosa作為雙相型真菌(即在環(huán)境中為菌絲相，在機(jī)體內(nèi)為酵母相引發(fā)感染)，無(wú)論在酵母相或是菌絲相均可合成黑素，可見黑素對(duì)于致病性孢子絲菌的生存十分重要[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，黑素可以降低申克孢子絲菌(S.schenckiisenusstricto)和巴西孢子絲菌(S.brasiliensis)對(duì)特比萘芬、兩性霉素B的敏感性[3，4]，但對(duì)于S.globosa的作用尚無(wú)報(bào)道。因此本文利用紫外照射法誘導(dǎo)的S.globosa白化突變株(MEL-)與黑素野生株(MEL+)，檢測(cè)對(duì)4種常見抗真菌藥的敏感性并探討黑素對(duì)抗真菌藥物的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

Sporothrixglobosa(FHJU 12082703)黑素野生株(MEL+)分離自孢子絲菌病臨床患者皮損組織(CAL基因序列GenBank登錄號(hào)為KT008664)，其白化突變株(MEL-)由吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并提供[5]。

1.2 主要試劑

氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)CZ)、特比萘芬(Terbinafine，TRB)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)購(gòu)自加拿大Tokyo Chemical Industry，兩性霉素B(Amphotericin B，AMB)購(gòu)自加拿大BBI公司。纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶購(gòu)自美國(guó)Genview公司。蛋白酶K購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 體外藥敏實(shí)驗(yàn)

利用瓊脂平板法檢測(cè)MEL+和MEL-，對(duì)4種抗真菌藥FCZ、TRB、ICZ和AMB的藥物敏感性。將保存的MEL+和MEL-菌接種至Potato Dextrose Agar(PDA)，28℃活化7 d。加入含0.5 % Tween 80的生理鹽水配置成終濃度為2×102 CFU/mL的孢子懸液，取100 μL涂布于含有不同濃度梯度的抗真菌藥物瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)72 h后菌落計(jì)數(shù)。每種抗真菌藥為倍比稀釋，各含5個(gè)藥物濃度，濃度范圍分別為FCZ 1 ～16 μg/mL；TRB 0.025 ～ 0.4 μg/ml；AMB 1 ～16 μg/mL；ICZ 0.0625～ 1 μg/mL。不含抗真菌藥物的瓊脂平板作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按生存率=(含藥平板菌落數(shù)/不含藥菌落數(shù))×100%，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 黑素的制備

按照宋洋[5]的方法制備S.globosa黑素，將活化的MEL+菌絲相接種至Potato Dextrose Broth(PDB)液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min，震蕩培養(yǎng)2個(gè)月。8層紗布過(guò)濾后離心獲得分生孢子。加入含濃度均為10 mg/mL纖維素酶、蝸牛酶和溶壁酶的1.0 mol/L山梨糖醇-0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，30℃震蕩消化過(guò)夜。離心并PBS洗滌3次，棄上清，加入4.0 mol/L硫氰酸胍溶液，室溫震蕩過(guò)夜。離心并PBS洗滌3次，蛋白酶K 37℃消化過(guò)夜，PBS洗滌3次，6.0 mol/L鹽酸煮沸1h。取上層黑色懸液，PBS，震蕩洗滌，離心取上層懸液，共3次。靜置，每日洗滌一次，至黑素顆粒逐漸沉淀后，離心，棄上清，光鏡下觀察。

1.5 紫外分光光度法檢測(cè)

利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)黑素對(duì)抗真菌藥物濃度的影響。取上述方法制備的100 μL黑素分別加入用甲醇溶解的4種抗真菌藥物，至終體積為200 μL，藥物終濃度分別為TRB 25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL；FCZ 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL；ICZ和AMB 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，于30℃，震蕩孵育12 h和24 h，0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后按照2010版中國(guó)藥典分別檢測(cè)吸光度(TRB檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，F(xiàn)CZ和ICZ檢測(cè)波長(zhǎng)為259，AMB檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm)。陰性對(duì)照組為不含黑素的等體積抗真菌藥液，空白對(duì)照組為等體積黑素。

1.6 高效液相色譜法檢測(cè)

利用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)黑素對(duì)AMB的作用。配置濃度為128 μg/mL的AMB作為母液，分別取100 μL、50 μL、30 μL藥液，加入黑素補(bǔ)足200 μL。30℃，震蕩孵育24h后，0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，利用Agilent 1260高效液相色譜儀檢測(cè)(美國(guó)安捷倫公司)。色譜條件如下[6]，色譜柱：Extend-C18柱，(5μm，250 mm×4.6mm)；流動(dòng)相：(A)乙腈，(B)2.5 mmol/L EDTA；檢測(cè)波長(zhǎng)：383nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：精密吸取供試品溶液20μL；梯度洗脫時(shí)間：0 ～ 15 min，A液為30%，B液為70%，16 min及以后，A液為100%。黑素和AMB母液各200 μL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 18.0軟件，采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Graphpad Prism 5軟件將數(shù)據(jù)繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外藥敏實(shí)驗(yàn)

菌株MEL+和MEL-分別接種于不同濃度梯度的含藥瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)72h后，肉眼計(jì)菌落數(shù)。與對(duì)照組相比，計(jì)算生存率。結(jié)果如圖1顯示，MEL+在ICZ和TRB的含藥平板上，隨著藥物濃度的降低，生存率逐漸升高，在ICZ濃度為0.5 μg/mL和1 μg/mL時(shí)不生長(zhǎng)，而對(duì)于AMB和FCZ的各個(gè)濃度間無(wú)顯著差異，生長(zhǎng)率接近100%。MEL-則在AMB和TRB含藥平板上隨著藥物濃度的降低，生存率逐漸升高，而在ICZ含藥平板的各個(gè)濃度上均未生長(zhǎng)。在AMB的4～16 μg/mL和ICZ的0.06～0.25 μg/mL濃度間，MEL-生存率小于MEL+，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.1Antifungal drug susceptibility test(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 紫外分光光度法檢測(cè)

將不同的抗真菌藥液與黑素孵育12h或24h后，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)藥液的吸光度，觀察濃度的變化情況。結(jié)果顯示(圖2)，藥液加入黑素孵育12 h和24 h后，藥液濃度均呈現(xiàn)不同程度的降低。而AMB所有濃度均顯著降低(p<0.01)，TRB為100 μg/mL時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ICZ孵育12 h后，10 μg/mL和20 μg/mL有差異(P<0.05)，孵育24 h時(shí)，僅20 μg/mL差異顯著(P<0.01)。FCZ在所有濃度均無(wú)差異(P>0.05)。

2.3 高效液相色譜法檢測(cè)

為了觀察AMB加入黑素的變化情況，我們利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，AMB在C-18柱、檢測(cè)波長(zhǎng)為383 nm時(shí)，保留時(shí)間約為5.2 min左右(圖3-A)，而在此時(shí)黑素幾乎無(wú)吸收(圖3-E)。隨著藥液濃度的降低和黑素濃度的升高，在保留時(shí)間為3.8 min、4.2 min和4.7 min左右出現(xiàn)吸收峰，尤其在50 μL AMB + 150 μL黑素(圖3-C)和30 μL AMB + 170 μL黑素(圖3-D)，峰形變化明顯。

圖2球形孢子絲菌黑素對(duì)抗真菌藥物濃度的影響(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.2The effect ofSporothrixglobosamelanin on concentration of antifungal drugs(*P<0.05，**P<0.01)

3 討論

根據(jù)合成途徑的差異，黑素可分為3種：DHN-melanin、eumelanin(L-DOPA途徑)、promelanin(L-tyrosine途徑)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌(Cryptococccusneoformans)[7]、巴西副球孢子絲菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)[8]、組織莢膜胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)[7]和馬內(nèi)菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei)[9]可利用eumelanin抵御抗真菌藥物的殺傷，而足馬杜拉分支桿菌(Madurellamycetomatis)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)則依賴于DHN-melanin[10]。現(xiàn)已證實(shí)，致病性孢子絲菌包括S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto和S.globosa，無(wú)論酵母相或是菌絲相，均可通過(guò)上述3種途徑合成黑素[2]，而且合成黑素的能力越強(qiáng)，菌株侵襲力越強(qiáng)[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，孢子絲菌復(fù)合體之一，盧艾里孢子絲菌(S.luriei)的菌絲相只能合成pyomelanin，而酵母相不能合成任何種類的黑素，S.luriei幾乎不致病或許與此相關(guān)[12]。

圖3高效液相色譜圖：A：128 μg/mL AMB ；B：100 μL， 128 μg/mL AMB + 100 μL 黑素；C：50 μL， 128 μg/mL AMB + 150 μL黑素；D：30 μL， 128 μg/mLAMB + 170 μL 黑素；E：200 μL 黑素

Fig.3HPLC chromatogram：A：128 μg/mLAMB ；B：100 μL 128 μg/mL AMB + 100 μLmelanin；C：50 μL， 128 μg/mL AMB + 150 μL melanin；D：30 μL， 128 μg/mLAMB + 170 μL melanin；E：200 μL melanin

Mario[4]通過(guò)向培養(yǎng)基添加黑素前體的方式，首次證明黑素具有保護(hù)S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto抵御AMB殺傷的作用。Rodrigo[3]則通過(guò)添加黑素合成抑制劑三環(huán)唑發(fā)現(xiàn)，黑素可以抵御TRB的殺傷，但是由于三環(huán)唑的抑制作用廣泛，因而無(wú)法明確是哪種黑素發(fā)揮作用。我們利用紫外照射誘變法構(gòu)建的白化突變株，直接證明了黑素可以保護(hù)菌株對(duì)抗真菌藥物的殺傷。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們采用了CLSI推薦的液基微量稀釋法，但是結(jié)果顯示MEL-在RPMI 1640為液基培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)照組需要5 d才能完全生長(zhǎng)，而此時(shí)MEL+則生長(zhǎng)過(guò)度，無(wú)法讀取MIC值，因而改用含藥平板涂布法，通過(guò)計(jì)菌落數(shù)的比值進(jìn)行分析。在以往微量稀釋法的藥敏試驗(yàn)中，TRB的MIC值(0.03 ～ 0.06 μg/mL)遠(yuǎn)低于ICZ(0.25 ～ 1 μg/mL)，但結(jié)果顯示含藥平板涂布法對(duì)TRB的抑菌作用影響最大[13，14]，提示該方法可能影響了TRB的生物利用度。FCZ和ICZ同屬唑類化合物(主要通過(guò)抑制真菌細(xì)胞色素P450對(duì)羊毛固醇14α脫甲基作用，從而抑制麥角固醇的合成)，區(qū)別只在于兩者對(duì)細(xì)胞色素P450的作用位點(diǎn)不同[15]。結(jié)果顯示，F(xiàn)CZ對(duì)MEL+和MEL-的生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用，這與微量稀釋法的藥敏結(jié)果相似，不僅印證了S.schenckiisenuslato對(duì)FCZ是天然耐藥，而且表明MEL-中FCZ的作用靶點(diǎn)未發(fā)生突變。與MEL+相比，MEL-對(duì)AMB和ICZ較為敏感，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是對(duì)ICZ，在0.06 ～ 1 μg/mL范圍內(nèi)均未生長(zhǎng)，表明黑素具有保護(hù)S.globosa抵御AMB和ICZ的作用，這可能是由于黑素的缺失，增加了AMB和ICZ在真菌細(xì)胞內(nèi)的濃度，使藥物殺傷效率增加，提示使用抗黑素合成類的藥物(三環(huán)唑)會(huì)增加抗真菌藥物的作用，即兩者的關(guān)系為協(xié)同作用，Almeida-Paes[3]和Mario[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不同程度地證實(shí)了該假設(shè)。在本實(shí)驗(yàn)中，由于在培養(yǎng)過(guò)程中未添加任何前體物，因此可能是DHN-melanin發(fā)揮了作用，但是不排除S.globosa其他類型的黑素也具有相同功能，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

有文章推測(cè)[16]，黑素可能通過(guò)吸附或轉(zhuǎn)化抗真菌藥物，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而保護(hù)菌株。為了探討黑素抵御抗真菌藥的作用機(jī)制，我們利用紫外分光光度法檢測(cè)了黑素對(duì)抗真菌藥物濃度的影響。結(jié)果顯示，黑素對(duì)各組抗真菌藥物12h和24h的作用結(jié)果相似，均對(duì)FCZ的濃度無(wú)影響，但可明顯降低AMB各組以及ICZ和TRB高劑量組的濃度。黑素對(duì)AMB濃度影響更顯著，這可能由于一方面AMB可直接與真菌細(xì)胞膜的麥角固醇結(jié)合，形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞離子外泄，引起真菌死亡[17]。而AMB為多烯類化合物，分子量較大，因此黑素對(duì)于AMB的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收影響最大。同時(shí)黑素可通過(guò)屏蔽作用，降低AMB對(duì)麥角固醇的結(jié)合。另一方面，AMB本身具有黃色，對(duì)紫外分光光度法的檢測(cè)較為敏感。為了進(jìn)一步確定黑素對(duì)AMB的作用方式，我們利用HPLC法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。圖譜顯示，與對(duì)照組相比，加黑素組出現(xiàn)了新峰，并且與AMB特征峰相鄰，可能表明黑素對(duì)AMB進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。下一步可嘗試?yán)觅|(zhì)譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌黑素能夠抵御AMB和ICZ對(duì)菌株的殺傷，并提示黑素可能對(duì)AMB進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而降低藥物濃度。