田超群綜述，周 汛審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科 400016）

孢子絲菌病又稱玫瑰花園丁病，是由申克孢子絲菌引起的皮下組織真菌病，孢子絲菌由Schenck于1898年在美國(guó)分離[1]。申克孢子絲菌分布于全球的土壤中，而孢子絲菌病則局限于墨西哥、中南美洲和其他地區(qū)，最常見的感染方式是皮膚接種，最典型皮損是淋巴皮膚型或者孢子絲菌病樣型，即原發(fā)部位感染后沿淋巴管播散的類型。申克孢子絲菌為一種雙相型真菌，在室溫25℃下為菌絲相，37℃下為酵母相，酵母相可在感染者體內(nèi)增殖，形成小的芽生孢子而致病[1]。臨床上常根據(jù)患者病史、皮損狀況、組織真菌分離培養(yǎng)、組織病理觀察、血清學(xué)、免疫組化檢測(cè)等方法診斷孢子絲菌病，但傳統(tǒng)診斷方法不僅耗費(fèi)時(shí)間且誤診率高。因此研究一項(xiàng)快速靈敏，特異性高的診斷技術(shù)十分必要。分子生物學(xué)診斷方法尤其是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及其相關(guān)技術(shù)，不但簡(jiǎn)單、快捷，且特異性高，近年來越來越受人們的重視。

1 PCR技術(shù)

從1994年Chua等[2]報(bào)道使用PCR技術(shù)檢測(cè)申克孢子絲菌以來，基于其操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，這項(xiàng)技術(shù)越來越多地被人們用于孢子絲菌的研究。PCR技術(shù)不僅可用于檢測(cè)環(huán)境中、動(dòng)物組織、臨床皮損中的孢子絲菌，還可用于孢子絲菌與相關(guān)類群的分類學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)新的種類，且可用于菌株耐藥性研究。朱建國(guó)等[3]篩選出申克孢子絲菌特異性引物S2－R2成功鑒定了動(dòng)物組織、人石蠟切片和臨床皮損中的孢子絲菌。應(yīng)用該引物檢測(cè)石蠟切片中的孢子絲菌陽性率高達(dá)91%，檢測(cè)臨床新鮮活組織中的孢子絲菌，以真菌培養(yǎng)為參照，陽性率可達(dá)100%。該方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出孢子絲菌，敏感性及特異性很高，可以用于臨床快速診斷孢子絲菌病。Liu等[4]采用相同的方法檢測(cè)臨床皮損中的孢子絲菌，83.3%（25/30）的皮損中可檢測(cè)出孢子絲菌，且PCR檢測(cè)出的孢子絲菌皮損的病例有95.6%真菌培養(yǎng)為陽性。2007年Marimon等[5]采用PCR技術(shù)聯(lián)合不同培養(yǎng)基、不同溫度菌株生長(zhǎng)率等方法將127例孢子絲菌分為7類，包括S.mexicana、S.brasiliensis、S.globosa和S.schenckii等，并且發(fā)現(xiàn)前面3種新分類，這種分類方法一直被世界公認(rèn)。Oliveira等[6]應(yīng)用表型實(shí)驗(yàn)（phenotypic test）及PCR技術(shù)（以鈣調(diào)蛋白基因?yàn)橐铮┭芯?0例S.schenckii（包括31例從人體分離的菌株和9例從動(dòng)物分離的菌株）及其對(duì)抗真菌藥物的敏感性，結(jié)果這40例申克孢子絲菌被分成了4類：S.albicans（n＝1）、S.brasiliensis（n＝1）、S.lueiei（n＝1）和S.schenckii（n＝37），他們的實(shí)驗(yàn)得出S.albicans和S.lueiei對(duì)伊曲康唑耐藥，且對(duì)所有唑類藥物耐藥性均較高。從動(dòng)物分離的孢子絲菌對(duì)伊曲康唑的耐藥性高于從人體分離的菌株，但對(duì)于特比萘芬和兩性霉素B所有菌株的敏感性相差不大，因此，孢子絲菌的準(zhǔn)確分類對(duì)于治療藥物的選擇是相當(dāng)重要的。PCR還可用于孢子絲菌雙向轉(zhuǎn)換技術(shù)的研究，Valle－Aviles等[7]用PCR檢測(cè)出鈣/鈣調(diào)蛋白激酶家族中的新成員：SSCMK1，它可能參與孢子絲菌的雙向轉(zhuǎn)換。

2 巢式PCR技術(shù)

巢式PCR同PCR一樣不僅可用于孢子絲菌診斷，還可用于孢子絲菌分類及其對(duì)抗真菌藥物的研究，而且有的實(shí)驗(yàn)還證明巢式PCR比普通PCR檢測(cè)孢子絲菌的靈敏性更高[8]。王連明等[9]運(yùn)用巢式PCR及特異性引物來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠組織中的申克孢子絲菌，11只有明顯皮損表現(xiàn)的小鼠中9只可檢測(cè)出申克孢子絲菌特異性DNA，但并不是所有研究都表明巢式PCR技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Mendoza等[10]比較真菌鏡檢、真菌培養(yǎng)、巢式PCR技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)小鼠器官中的孢子絲菌，其中真菌培養(yǎng)和抗體檢測(cè)陽性率較高，而巢式PCR技術(shù)和真菌鏡檢的陽性率稍低。巢式PCR技術(shù)還可用于孢子絲菌分類，Xu等[11]運(yùn)用巢式PCR技術(shù)檢測(cè)38株不同地方的孢子絲菌，他們研究的菌株包括從動(dòng)物和人體分離的孢子絲菌，并和其他類型的真菌作比較，結(jié)果表明巢式PCR技術(shù)對(duì)于鑒別不同種類的申克孢子絲菌具有很高的敏感性和特異性，為孢子絲菌病的快速診斷提供了一種新方法。Galhardo等[12]分別從申克孢子絲菌的表型和基因型研究菌株對(duì)抗真菌藥物的最低抑菌濃度，其研究表明菌株的耐藥性和基因型是密切相關(guān)的，而不同地區(qū)的孢子絲菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥性也是不同的。

3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－RFLP）技術(shù)

PCR－RFLP技術(shù)主要應(yīng)用于孢子絲菌菌種的鑒別，由于其標(biāo)記需使用內(nèi)切酶，對(duì)實(shí)驗(yàn)室及操作人員要求較高，近年來研究較少。Kawasaki等[13]運(yùn)用線粒體DNA聯(lián)合PCR－RFLP技術(shù)鑒別申克孢子絲菌的兩種不同基因型菌株American Type Culture Collection 10268of mtDNA type 1和KMU2025of mtDNA type 4，這兩種菌株主要不同點(diǎn)定位于atp9和cox2基因，并且發(fā)現(xiàn)這種運(yùn)用限制性內(nèi)切酶Asel的方法比其他運(yùn)用核DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間的PCR－RFLP技術(shù)更適合于孢子絲菌種的鑒別。

4 反向PCR技術(shù)

反向PCR技術(shù)主要用于孢子絲菌的雙向轉(zhuǎn)換機(jī)制及其基因結(jié)構(gòu)研究，對(duì)于了解孢子絲菌病的致病機(jī)制有重要意義。Robledo－Ortiz等[14]運(yùn)用反向PCR技術(shù)及簡(jiǎn)并引物發(fā)現(xiàn)了申克孢子絲菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖苷酶Ⅱ的編碼基因rot2，這個(gè)基因編碼的蛋白與孢子絲菌的結(jié)構(gòu)、致病性及免疫有關(guān)。Hou等[15]的實(shí)驗(yàn)中用實(shí)時(shí)定量的反向PCR技術(shù)表明SsDRK1基因在孢子絲菌的酵母相中比菌絲相中表達(dá)更高，表明SsDRK1基因可能與孢子絲菌的雙向轉(zhuǎn)換機(jī)制有關(guān)。Nishizawa等[16]發(fā)現(xiàn)在申克孢子絲菌的雙相轉(zhuǎn)換中Pho85細(xì)胞周期素依賴激酶的表達(dá)被抑制。通過定量反向PCR檢測(cè)到在酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換中PhoSs基因的表達(dá)下降了30倍，表明PhoSs可能參與申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換的調(diào)控。

5 其他PCR相關(guān)技術(shù)

其他PCR相關(guān)技術(shù)，例如交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR（TAILPCR）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（PAPD）等常用于孢子絲菌的流行病學(xué)及轉(zhuǎn)基因等。Zhang等[17]將玉米轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)用于申克孢子絲菌的插入誘變研究中，并運(yùn)用TAIL－PCR克隆T－DNA（Transferred DNA轉(zhuǎn)化DNA），為未來醫(yī)學(xué)上重要真菌的正向和反向遺傳學(xué)研究提供了重要的突變體。Reis等[18]運(yùn)用PAPD技術(shù)及DNA指紋分析技術(shù)分析了里約熱內(nèi)盧19例從人體分離的孢子絲菌、25例從貓分離的孢子絲菌和2例其他來源的孢子絲菌，實(shí)驗(yàn)表明里約熱內(nèi)盧的動(dòng)物和人孢子絲菌病有共同的傳染源，同時(shí)貓?jiān)阪咦咏z菌病的播散中起重要作用。

PCR及其相關(guān)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、敏感、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，不僅能用于快速診斷孢子絲菌病，還能用于孢子絲菌的分類、藥物選擇、孢子絲菌病的流行病學(xué)研究等方面，具有較大發(fā)展空間，是今后孢子絲菌病診斷及孢子絲菌研究的發(fā)展方向。對(duì)于孢子絲菌病的診斷，尤其對(duì)于臨床表現(xiàn)不典型及系統(tǒng)性播散型孢子絲菌病的診斷具有更重大的意義，可以明顯降低孢子絲菌病的誤診率。而且這些技術(shù)能幫助研究孢子絲菌的雙向轉(zhuǎn)化機(jī)制，對(duì)其致病性有更好的了解，能從病因上研究孢子絲菌病。但這些技術(shù)由于對(duì)操作人員技術(shù)及實(shí)驗(yàn)室條件要求高，目前僅用于實(shí)驗(yàn)室診斷孢子絲菌病，暫未能在臨床上大量推廣。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信在不久的將來會(huì)成為孢子絲菌病臨床快速、準(zhǔn)確診斷的手段。目前發(fā)現(xiàn)與孢子絲菌雙向轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因不多，對(duì)其雙向轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不能完全明確，這需要科學(xué)工作者作出更大的努力。相信隨著新技術(shù)的不斷開發(fā)和研究的進(jìn)展，最終會(huì)明確孢子絲菌雙向轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

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