張曉龍 魯仁義 閻瀾 姜遠英

(中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

白念珠菌是人體常見的條件致病型真菌，可呈現出酵母態(tài)、假菌絲態(tài)及菌絲態(tài)三種完全不同的狀態(tài)[1]。在人體免疫力低下時，白念珠菌能夠穿過人體上皮屏障、侵入深部黏膜并播散進入血液循環(huán)中，導致嚴重的系統性真菌感染[2]。目前，臨床上白念珠菌感染面臨著病死率高、耐藥性強、特效藥物少等棘手問題[3]，因此，研究白念珠菌致病機理，對于開發(fā)新型抗真菌藥物具有重要意義。

SUN基因家族是一組真菌特異性基因家族，其蛋白質在C末端結構域具有高度相似性[4]。在釀酒酵母中，Sun蛋白家族最初在鑒定出芽酵母釀酒酵母中的四個旁系同源基因時被識別，即SIM1,UTH1,NCA3和SUN4基因[5]，這個家族的基因參與DNA復制、老化、線粒體合成和胞質分裂等多種細胞過程[6]。在白念珠菌中，SUN家族包括SUN41和SIM1兩個基因。研究表明，sun41蛋白具有糖苷酶功能，參與白念珠菌形態(tài)、細胞壁以及生物被膜形成。SUN41基因缺失菌會出現細胞分離障礙現象，其菌絲及生物被膜形成產生缺陷，黏附宿主的能力也顯著下降[7]。在本研究中，我們通過基因敲除獲得了SUN基因家族另一基因SIM1的基因缺失菌株，并對其表型和功能進行了初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 菌株SN152 (親本菌為SC5314，基因型為arg4Δ/arg4Δleu2Δ/leu2Δhis1Δ/his1ΔURA3/ura3Δ::imm434IRO1/iro1Δ::imm434)由美國加利福尼亞大學SuzanneM.Nobel教授饋贈。

試劑YeaStarGenomicDNAKit，購于ZymoResearch公司。YeastTransformationSystem2購于Clontech公司。DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDL10000購于Takara公司。Goldview染料購于北京賽百盛公司。磷酸鹽緩沖液 (phosphatebufferedsaline，PBS)購自上海博光公司。

藥物 氟康唑、咪康唑、酮康唑、卡泊芬凈、兩性霉素B、特比萘芬、剛果紅、熒光白購于Sigma公司，氯化鋰購于中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司。

培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基 (1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)、SDA固體培養(yǎng)基 (1%蛋白胨、4%葡萄糖、1.8%瓊脂、各藥物)、Spider液體培養(yǎng)基 (1%酵母浸膏、0.2%KH2PO4、1%甘露醇)、RPMI1640液體培養(yǎng)基 (1%RPMI1640、3.45%嗎啉基丙磺酸、0.2%NaHCO3)、SC固體培養(yǎng)基 (2%葡萄糖、0.67%酵母氮源、1.8%瓊脂、所需氨基酸)。

1.2 方法

菌株培養(yǎng) 于-80℃冰箱中將20%甘油凍存的白念珠菌SN152菌液接種至SDA固體培養(yǎng)基平板中，30℃倒置培養(yǎng)48h后挑取單個菌落繼續(xù)接種在SDA平板上，30℃再次活化48h。挑取單克隆接種于1mLYPD液體培養(yǎng)基，在30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)16h后用于實驗。

SIM1基因敲除實驗 使用醋酸鋰化學轉染[8]的方法，利用Overlap-PCR介導的HIS1-LEU2基因策略[9-10]，將C.dubliniensis中的HIS1和C.maltosa中的LEU2兩個標記同源重組替換SN152中SIM1基因，構建雙臂敲除菌，構建示意圖見圖1。首先以SN152基因組DNA為模板，SIM1_up_F、SIM1_up_R和SIM1_down_F、SIM1_down_R分別為引物PCR擴增SIM1基因上、下游片段。再用P2、P5分別以pSN52、pSN40為模板PCR擴增C.d HIS1marker和C.m LEU2marker。以SIM1基因上游、下游、HIS1或LEU2marker3個片段為模板，利用SIM1_up_F、SIM1_down_R為引物融合PCR擴增得到含有HIS1或LEU2的融合重組片段。然后利用醋酸鋰法將HIS1融合片段轉染進入白念珠菌SN152中，涂布于選擇性培養(yǎng)基SC-His平板上，48h后挑取菌落，抽提基因組DNA，PCR鑒定得到SIM1的單臂缺失菌，同樣方法轉染LEU2融合片段至SIM1單臂缺失菌中，在SC-His-Leu培養(yǎng)基上篩選生長，經PCR鑒定得到SIM1基因缺失突變菌SIM1Δ/Δ。菌株構建和鑒定所需引物應用NCBIPrimerdesigningtool設計，由上海生工公司合成，-20℃保存，各引物序列見表1。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

生長曲線實驗 從SDA平板挑取不同白念珠菌克隆至1mLYPD液體培養(yǎng)基，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)16h。離心收集菌體，用無菌PBS溶液洗滌3次，并用新鮮YPD調整菌濃度為1×106cells/mL，測菌液OD630nm值記為0h。將菌液繼續(xù)30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，于不同時間點測量菌液OD630nm值。

菌絲誘導實驗 活化菌株，用無菌PBS溶液洗滌3次，分別用RPMI1640、YPD+10%FBS、Spider液體培養(yǎng)基調整菌濃度為1.0×106cells/mL。將調整好的菌液分別加至12孔板并于37℃靜置培養(yǎng)3h，通過顯微鏡觀察菌絲形成情況。

黏附上皮細胞實驗 活化菌株，用無菌PBS溶液洗滌3次，用MEM培養(yǎng)基 (含20%胎牛血清)重懸菌株，調整濃度為1×105cells/mL，然后稀釋至終濃度為200cells/mL。待結腸癌上皮細胞 (Caco-2細胞)和口腔表皮樣癌細胞 (KB細胞)在6孔板中融合生長至80%～90%時，加入1mL上述菌液，然后置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育1h，吸棄上清液，用無菌PBS溶液輕輕洗3次，以未用PBS漂洗的樣本孔做對照。每孔加入1mL尚未凝固的YPD固體培養(yǎng)基 (45℃)，于30℃倒置培養(yǎng)48h，記錄生長的白念珠菌克隆數并計算黏附率。

生物被膜活性實驗 活化菌株，用無菌PBS溶液洗滌3次，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸菌株，調整濃度為1.0×106cells/mL。在96孔板中分別加入100μL調好濃度的菌液，于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h，然后輕輕吸棄上清的RPMI1640培養(yǎng)基，用無菌PBS溶液輕輕洗滌3次，于每孔分別加入150μLXTT/menadione混合液，37℃避光靜置孵育3h，最后吸取70μLXTT/menadione液體上清測OD495nm值。

Spotassay實驗 活化菌株，用無菌PBS溶液洗滌3次，并調整菌液濃度至1×107cells/mL，然后用無菌PBS連續(xù)10倍倍比稀釋5個濃度梯度。取3μL上述稀釋菌液點到各含藥SDA固體培養(yǎng)基上，將平板晾干，于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h，觀察菌落狀態(tài)并拍照。

表1 實驗所用引物及序列

2 結 果

2.1 SIM1基因缺失菌構建成功

鑒定結果如圖2所示。1%瓊脂糖凝膠電泳成功驗證出同源重組SIM1基因雙臂敲除菌HIS1和LEU2標記的上下游片段：HIS1上游(HIS1 Left+ up-SIM1)、下游(HIS1 Right+ down-SIM1)、LEU2上游(LEU2 Left+ up-SIM1)、下游(LEU2 Right+ down-SIM1)四個片段，大小分別為1 022 bp、1 136 bp、654 bp和1 124 bp。而SIM1基因中兩個ORF片段 (1_F+1_R,724bp)、(2_F+2_R,769bp)均沒有出現，說明白念珠菌SIM1Δ/Δ構建成功。

2.2 SIM1基因缺失后不影響白念珠菌的生長、繁殖

在宿主體內侵襲性生長、繁殖是白念珠菌逃逸宿主免疫攻擊，難以被宿主清除的主要方式之一。通過測定生長曲線可以考察SIM1基因缺失后對白念珠菌生長、繁殖的影響，結果如圖3所示，SIM1基因缺失菌SIM1Δ/Δ與親本菌SN152相比，生長繁殖速度無明顯變化。說明SIM1基因缺失后白念珠菌的生長、繁殖不受影響。

2.3 SIM1基因缺失后不影響白念珠菌菌絲形成

一般情況下，白念珠菌以酵母態(tài)與宿主共生，當宿主免疫功能降低時，白念珠菌轉化為具有侵襲性的菌絲態(tài)生長，對宿主造成侵襲性感染[11]。本實驗通過在不同液體培養(yǎng)基中誘導白念珠菌形成菌絲來考察SIM1基因缺失后對白念珠菌菌絲形成能力的影響。結果如圖4顯示，與親本菌SN152相比，SIM1基因缺失菌SIM1Δ/Δ的菌絲形成情況無明顯差異。

2.4 SIM1基因缺失導致白念珠菌對宿主上皮細胞的黏附能力降低

黏附是白念珠菌感染宿主過程中的第1步，也是影響白念珠菌致病力的重要因素。本實驗檢測了親本菌SN152和SIM1基因缺失菌SIM1Δ/Δ對宿主上皮細胞的黏附能力。結果如圖5所示，親本菌SN152和SIM1基因缺失菌SIM1Δ/Δ對Caco-2細胞的黏附率分別為76.50%和56.63%;對KB細胞的黏附率分別為78.87%和56.33%。與親本菌相比，白念珠菌SIM1Δ/Δ對上皮細胞的黏附能力顯著降低 (P<0.05)。

2.5 SIM1基因缺失后不影響白念珠菌被膜形成

生物被膜與白念珠菌感染密切相關，能大大增強白念珠菌對抗真菌藥物的耐藥性和對宿主免疫防御的抵御能力[12]。本實驗通過XTT法[13]考察親本菌SN152和SIM1基因缺失菌SIM1Δ/Δ在96孔板內壁上形成生物被膜的活性。結果如圖6所示，以親本菌SN152形成的生物被膜為參照，SIM1Δ/Δ菌的生物被膜與其沒有顯著差異。

圖1白念珠菌SIM1基因敲除菌株構建示意圖圖2PCR驗證SIM1基因雙臂敲除菌圖3SIM1基因缺失后不影響白念珠菌生長繁殖圖4SIM1基因缺失后不影響白念珠菌菌絲形成圖5SIM1基因缺失后白念珠菌對宿主上皮細胞黏附能力降低。實驗重復3次，數據采用mean±SD表示，t檢驗分析兩組間黏附率均數的統計學差異 (*.P<0.05)圖6SIM1基因缺失后不影響白念珠菌被膜形成。實驗重復3次，數據采用mean±SD表示，t檢驗分析兩組菌被膜形成率差異的統計學意義

Fig.1Schematic diagram of constructing deletion mutants forCandidaalbicansSIM1Fig.2PCR confirming disruption ofSIM1 two allelesFig.3Deletion mutants ofSIM1 did not affect the growth and reproductionFig.4Deletion mutants ofSIM1 did not affect the hyphae formationFig.5Deletion mutants ofSIM1 impair the adhesive ability to Caco-2 cells and KB cellsFig.6Deletion mutants ofSIM1 did not affect the biofilms formation

2.6 SIM1基因缺失后白念珠菌對剛果紅、熒光白的藥物敏感性增加

細胞壁是白念珠菌維持細胞形態(tài)、平衡滲透壓，保護自身免于環(huán)境脅迫的重要細胞器。目前，臨床上常見的抗真菌藥的作用機制主要通過破壞細胞壁及細胞膜的結構、通透性，達到殺滅或抑制真菌的目的[14]。本實驗通過spot assay實驗來考察SIM1基因缺失后白念珠菌藥物敏感性的變化。結果如圖7所示，與親本菌相比，SIM1基因缺失菌在剛果紅 (100 μg/mL)和熒光素白 (50 μg/mL)的含藥培養(yǎng)基上生長受到明顯抑制。剛果紅和熒光素白的作用靶點集中在細胞壁上，說明SIM1基因缺失后導致白念珠菌細胞壁發(fā)生改變，對藥物的敏感性增加。

3 討 論

基因敲除技術是研究白念珠菌基因功能的常用方法?；蚯贸夹g從最早的只有以URA3為篩選標記的Ura-Blast策略[15]，發(fā)展到以HIS、LEU2和ARG4為篩選標記的HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略[9]、以諾爾斯菌素為篩選標記 (SAT1)的諾爾斯菌素基因敲除法[16]等多種實驗方法。本實驗所采用的HIS1-LEU2策略不僅回避了URA3對白念珠菌毒力的影響，且具有篩選步驟少、轉染效率高等特點。

圖7 SIM1基因缺失后影響白念珠菌對部分外界應激的敏感性

Fig.7Deletion mutants ofSIM1 affect the sensitivity to some external stress (CFW.Calcofluor white,KTC.Ketoconazole,FLC.Fluconazole,AmB.Amphotericin B,MCZ.Miconazole)

有研究表明，白念珠菌SUN基因家族中SUN41基因功能涉及母細胞和子細胞分離時廣泛的細胞壁重塑，SUN41基因失活會導致白念珠菌細胞分離障礙和菌絲形成缺陷[7]。本實驗結果表明SIM1基因失活僅造成白念珠菌黏附能力下降和對剛果紅、熒光素白的的敏感性增加，而不會對白念珠菌細胞分離障礙和菌絲形成造成影響。在釀酒酵母和裂殖酵母中，SUN基因已證實與RAM-Ace2p信號通路相關聯，該信號通路通過調節(jié)子細胞中編碼細胞壁降解酶基因的特異性表達促進母細胞細胞壁降解，在細胞分離中發(fā)揮著重要作用[17]。釀酒酵母中SIM1基因通過改變細胞壁成分維持細胞分離后母細胞細胞壁的完整性，不影響子細胞Ace2p的特異性定位也不抑制細胞分離[18]。白念珠菌的SIM1基因與釀酒酵母的SIM1基因同源，具有58.8%相似性。在本實驗中，SIM1基因缺失后白念珠菌的生長、菌絲形成、細胞分離均不受影響，而對剛果紅、熒光白的藥物敏感性增加。種種跡象表明白念珠菌SIM1基因功能與釀酒酵母SIM1基因功能極為相似。值得一提的是，剛果紅和熒光白兩種藥物均與幾丁質的生物合成相關。白念珠菌SIM1基因是否通過調節(jié)幾丁質生物合成從而改變細胞壁成分，并進一步影響白念珠菌對宿主的黏附值得進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建了白念珠菌SUN基因家族另一基因SIM1的基因缺失菌，并對其功能進行了初步探究，為進一步闡釋SUN基因家族在白念珠菌生長、傳代和與宿主相互作用中的功能提供了基礎。