徐慧慧 蔣伶活，2

(1.江南大學生物工程學院 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122；2.山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，淄博 255000)

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種人體共生菌，對免疫功能缺陷的患者能夠引起系統(tǒng)感染，嚴重時會導致患者死亡[1-2]。白念珠菌感染宿主細胞時，會遭遇到宿主細胞的防御壓力(例如，發(fā)熱、氧化應激，以及亞硝化作用)，環(huán)境壓力(例如，腸道中的低氧和唾液與上皮層中的抗真菌多肽)。這些壓力直接作用于白念珠菌的細胞表面。真菌表面的細胞壁是一種動態(tài)的結構，對維持細胞形態(tài)，保護細胞免受環(huán)境壓力的破壞十分重要。和其他酵母細胞一樣，白念珠菌的細胞壁由糖骨架組成，主要成分是β-葡聚糖，幾丁質(zhì)和甘露聚糖。β-1，3 和 β-1，6葡聚糖組成一個網(wǎng)絡結構，被磷酸肽鍵甘露聚糖(phosphopeptidomannan， PPM)、甘露聚糖蛋白(mannoproteins)和磷脂甘露聚糖(phospholipomannan， PLM)組成的復合糖外層包圍[3-4]。磷酸肽鍵甘露聚糖、甘露聚糖蛋白和磷脂甘露聚糖統(tǒng)稱為甘露聚糖綴復合物，這些寡聚甘露糖綴復合物在白念珠菌與宿主的關系中發(fā)揮重要作用，與白念珠菌毒力緊密相關[5-8]。寡聚甘露糖通過β-1，2 鍵連接，形成一種獨特的空間構象，能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識別。甘露聚糖通過由β-1，2連接的甘露糖殘基與磷脂連接形成PLM。白念珠菌釋放的PLM中的β-寡聚甘露糖可以與宿主細胞作用，通過宿主細胞上的Toll-like receptor-2誘導TNF-α合成[9-11]。盡管目前對β-甘露聚糖在白念珠菌病理生理學中的功能有諸多認識，但是對β-甘露聚糖基化的調(diào)控尚不清楚白念珠菌的β-甘露糖基轉移酶(mannosyltransferase)參與β-甘露聚糖鏈的合成[12]。CaMIT1編碼GDP-甘露糖﹕肌醇-磷酸-酰胺(inositol-phospho-ceramide， IPC)甘露糖轉移酶[13]。CaMIT1突變株缺少PLM，IPCs不能夠被甘露糖基化形成Mannose IPC (MIPC )，從而影響白念珠菌毒力。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對鈣離子敏感。為了進一步研究Mit1p在鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，我們利用一種新的基因編輯手段CRISPR去構建CaMIT1基因的突變株。

CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)體系，已被運用到真菌、植物和動物的研究領域中[14-15]。Fink教授實驗室基于這項技術的原理，構建了在白念珠菌中可以操作的CRISPR體系，證明這種方法可以有效地編輯白念珠菌基因組[16]。白念珠菌CRISPR體系，由白念珠菌兼容性的Cas9核酸酶和一個合成的導向RNA(synthetic guide RNA)組成，sgRNA能夠與基因組上特異性的20個堿基的序列進行雜交，sgRNA識別的序列緊跟著一個由NGG組成的PAM(Protospacer-Adjacent Motif)位點，Cas9蛋白能夠識別PAM位點并在此位點進行剪切，因此sgRNA具有指導Cas9蛋白到基因組特定PAM位點的功能。CRISPR體系可以通過一步轉化法獲得兩個等位基因同時失活的純合子突變株，為基因功能和毒力研究提供了一種簡單而快速的手段。以CaMIT1基因為例，我們成功通過這種方法獲得了兩個等位基因同時失活的CaMIT1純合子突變株，并通過倍比稀釋對Mit1p的功能進行了初步分析。

1 材料

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所用到菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物，固體培養(yǎng)基滅菌前加入20g/L瓊脂粉；YPD培養(yǎng)基含藥物：YPD培養(yǎng)基濕熱滅菌后，加入相應濃度的藥物；LB+氨芐霉素培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化鈉，5g/L酵母提取物，調(diào)整pH到7.0，滅菌后加入100 μg/mL 氨芐霉素，固體培養(yǎng)基滅菌前加入20g/L瓊脂粉。

1.3 主要試劑

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 實驗所用引物序列

酵母轉化用Salmon Sperm DNA (ssDNA)、LiAc、PEG 3350， 以及細胞裂解酶lyticase等試劑購自Sigma公司；所用藥物諾爾斯菌素(nourseothricin， NAT)、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等試劑購NEB公司。熒光增白劑(CFW)、酮康唑(KCZ)、氟康唑(Flu)和特比萘芬(Teb)等購自Sigma公司；氯化鈣，氯化理和SDS購自國藥集團。

1.4 主要儀器及設備

PCR反應儀(德國艾本德公司)、全溫搖瓶柜(太倉強樂實驗設備廠)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、核酸電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio. Rad)、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 引物設計

需要設計三對引物。(1)sgRNA引物設計。sgRNA是由20bp堿基組成的序列。Vyasetal. 2015的補充數(shù)據(jù)中包含有不同的sgRNA序列，選擇文件(Targ.NoTs.subs12nt.HitsGenesOnly.

Hits1Gene2 Alle.3letterName)，也可以利用軟件Benchling進行查找。sgRNA有以下兩個標準：a) sgRNA應在目的基因ORF內(nèi)，且靠近起始密碼子ATG，盡早終止有功能蛋白質(zhì)的合成；b) On-Target和Off-Target分數(shù)越高越好，分數(shù)高表明sgRNA結合的特異性強。sgRNA需要連接到質(zhì)粒pV1093上，質(zhì)粒pV1093用BsmBI進行酶切后暴露出黏性末端，需在引物兩端添加黏性末端，正向引物為5’-atttgX20g-3’(表2，MIT1-sgF)，反向引物為5’-aaaacX20c-3’ (表2，MIT1-sgR)，PAM位點應該在sgRNA的3’端(如圖1C)。(2)修復模板DNA(Repair DNA)引物設計。修復模板DNA含有突變位點和同源臂，根據(jù)需要進行修飾。在構建突變株時，通過堿基修飾導入終止密碼子，有3點需要修飾的地方：a) 至少一個終止密碼子(UAA， UAG 或UGA)，且該終止密碼子必須在基因ORF中；b) 破壞PAM位點，例如將NGG中的一個G替換成其他堿基；c)為了篩選正確的轉化子，引入一個或者消除一個酶切位點。最好選擇常用的，且酶切效率較高的限制性酶切位點(EcoRI，BamHI，HindⅢ，NdeI，XbaI，XhoI)，如圖1E。此外，在正向和反向引物的5’末端分別添加40bp的sgRNA兩側的同源序列(表2，MIT1-repairF/ MIT1-repairR)；(3)篩選引物設計。在sgRNA的兩側設計正向和反向引物，擴增出一條1kb左右的條帶。兩條引物與sgRNA的位置在200bp以上(見表2，MIT1-CF/ MIT1-CR)。

2.2 sgRNA克隆

用限制性核酸內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切2 μg載體pV1093，55 ℃酶切20 min后用CIP酶37 ℃處理1 h，用片段純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。同時用T4 Polynucleotide kinase對sgRNA的引物進行退火添加磷酸基團。最后將退火后得到的寡聚核苷酸片段與載體用T4 Ligase進行連接。

2.3 白念珠菌的轉化

將克隆獲得的質(zhì)粒pV1093-sgRNA用KpnⅠ和SacⅠ進行酶切，并純化回收；同時以修復模板DNA引物做PCR獲得修飾模板，并純化回收。將回收后的質(zhì)粒和模板DNA用LiAc轉化方法同時轉化進入白念珠菌細胞。具體操作步驟為：將白念珠菌細胞在YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，轉接到5 mL新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，調(diào)整OD600為0.1，培養(yǎng)5 h后3000 r/min離心5 min收集細胞。用0.1 mol/L的LiAc洗滌細胞1次，再次用3000 r/min離心5 min收集細胞，最后用100 μL 的0.1 mol/L LiAc將細胞重懸，并加入10 μL提前煮沸過的10 mg/mL的Salmon Sperm DNA (ssDNA)，2 μg酶切后的質(zhì)粒以及2 μg的修復模板DNA模板，吹吸混勻后加入600 μL 40 % PEG/0.1 mol/L LiAc緩沖液，充分混勻。42℃熱激30 min，離心棄上清后，用2 mL YPD培養(yǎng)基轉移到試管中，200 r/min、室溫(25 ℃)復蘇過夜后，取1.5 mL培養(yǎng)物離心水洗，涂布在含有200 μg/mL NAT的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，將獲得轉化子在200 μg/mL NAT的YPD平板上劃線，30℃培養(yǎng)1 d后進行菌落PCR驗證。

2.4 菌落PCR驗證轉化子

菌落PCR主要包括兩個步驟：一是處理細胞獲得足夠質(zhì)量和數(shù)量的基因組DNA；二是PCR反應。

具體操作步驟：1、基因組DNA的制備。在冰上配制裂解體系：1/50體積Lyticase(20 Unit/μL)，5X Taq Buffer，加水補充體積，并分裝到PCR管或者96孔PCR板中，每個樣品25 μL的體系；用扁頭牙簽挑取轉化子，在裂解體系中混合均勻，室溫放置30～60min；加入100 μL水，95℃處理5min，使蛋白失活；3000 r/min離心10 min，上清液即基因組DNA。2、PCR反應。根據(jù)所用Taq酶的使用說明進行PCR的體系的配制和程序設置。

2.5 表型實驗

挑取菌株單菌落接種到3 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃ 220 r/min 過夜培養(yǎng)16 h，調(diào)整OD600值為2，倍比稀釋得到細胞濃度分別為2×107cells/mL、2×106cells/mL、2×105cells/mL、2×104cells/mL和2×103cells/mL。每個菌株，每個濃度吸取2.5 μL，點到YPD和含有不同藥物的固體培養(yǎng)基上，從右到左濃度遞增，在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d拍照觀察結果。

3 結果

3.1 CRISPR/Cas9方法構建白念珠菌CaMIT1基因的突變株

按照Fink教授實驗室構建的白念珠菌CRISPR/Cas9體系[16](見圖1)，我們首先構建含有CaMIT1的sgRNA的 pV1093質(zhì)粒，并通過測序驗證， 得到正確的pV1093- sgMIT1質(zhì)粒。用KpnⅠ和SacⅠ同時對pV1093- sgMIT1質(zhì)粒進行酶切，獲得11 kb 和3 kb左右的兩條片段 (見圖2D) ，其中大片段包含有CaCas9p表達體系、sgRNA表達體系，以及NatR基因，并將通過片段兩端的ENO1基因同源序列整合到基因組的ENO1基因位點。pV1093- sgMIT1質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物與修復模板DNA(見圖2E)一起轉化到白念珠菌的野生型菌株SN148，在含有200 μg/mL 的YPD固體培養(yǎng)基上能獲得100以上的轉化子。對轉化子進行基因型驗證(圖2F、2G)。通過PCR，以野生型菌株和CaMIT1突變株的基因組DNA為模板，都能擴增出1kb左右的DNA條帶(見圖2F)。由于經(jīng)過CRISPR編輯后的基因組序列中引入了一個XbaⅠ酶切位點，而野生型基因序列中沒有，所以用XhaⅠ酶對PCR產(chǎn)物進行酶切后，從CaMIT1突變株基因組中擴增出的1kb PCR產(chǎn)物會被切成400 bp和660 bp兩個小片段，而從未經(jīng)過編輯的野生型菌株基因組中得到的1kb PCR產(chǎn)物則不會被切成兩個小片段(見圖2G)。在15個轉化子中，1、2、3、4、5、7、8、9、12、13可能是成功編輯過的突變菌株，此酶切效率達到60%以上。由于白念珠菌是雙倍體，不能被XbaⅠ酶切完全的PCR產(chǎn)物有可能是來自雜合子的基因組DNA，所以我們挑選被XbaⅠ酶切完全的PCR產(chǎn)物進行測序。包括我們獲得的3個轉化子mit1-1(HHCA1)、mit1-2(HHCA1)、mit1-3(HHCA1)就是從9個轉化子(圖2中的1-5，8，9，12，13號)中經(jīng)過對它們的PCR產(chǎn)物進行測序獲得的。測序結果表明這3個轉化子中CaMIT1基因都產(chǎn)生了預期的突變。

圖1白念珠菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)。(A) 由質(zhì)粒pV1093組成的單一體系，整合到基因組上ENO1基因位置。(B) pV1093質(zhì)粒圖譜。CaCas9p蛋白的3’末端融合有3X SV40核定位信號和3X FLAG標簽。CaCas9p的啟動子是組成型表達的ENO1啟動子，同時是CaCas9p整合到基因組上的整合位點。利用RNA聚合酶ⅢⅢ的啟動子SNR52p來表達sgRNAs。(C) 用BsmBⅠ酶切質(zhì)粒pV1093，同時將設計的導向序列(紅色框架內(nèi)是CaMIT1導向序列)退火，并將退火后的寡聚核苷酸(陰影部分序列) 連接到質(zhì)粒上構建導向表達系統(tǒng)。(D) Cas9突變方法的原理圖。這種系統(tǒng)能夠在基因的特定(*，PAM位點)位點產(chǎn)生純合子突變，同時使序列突變來阻止在整合后重復剪切。(E) 野生型和突變株在CaMIT1突變位點的序列。兩個連續(xù)的終止密碼子在CaMIT1的閱讀框架(ORF)上。在PAM位點引入了XbaⅠ限制性酶切位點。

Fig.1Candida albicans CRISPR/Cas9 system. (A) The solo system consists of one plasmid， pV1093， which targets ENO1. (B) Restriction map of plasmid pV1093. The CaCAS9 gene is fused to sequences encoding the 3X SV40 nuclear localization signal and 3x FLAG tag for in-frame fusion to the 3’ end of the gene. The CaCas9p from this construct is expressed from the constitutive ENO1 promoter at the plasmid integration site. The RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter SNR52p was used to control of sgRNA expression. (C) Cloning strategy of guide sequence. oligos (shaded sequences) with desired guide sequence (CaMIT1 guide sequence in red box) are annealed， digested with BsmBI and ligated with BsmBⅠ-digested pV1093 vector. (D) Illustration of gene editing process. The CRISPR/Cas9 system creates homozygous mutations in the target gene (*， PAM site). (E) Comparison between DNA sequences ofCaMIT1 loci in the wild-type and the mutant. Two consecutive stop codons are shown within the mutated region. XbaⅠ restriction enzyme site is introduced at the PAM region.

3.2 CaMIT1突變株表型分析

在SN148遺傳背景下，CaMIT1突變株對0.4 mol/L和0.6 mol/L CaCl2表現(xiàn)為極為敏感(如圖3A)。環(huán)孢霉素A是鈣離子/鈣調(diào)磷酸酯酶信號途徑中，鈣調(diào)磷酸酯酶的抑制劑，能夠抑制鈣信號途徑的激活[18-19]。培養(yǎng)基中加入50 μg/mL環(huán)孢霉素A(Cyclosporine A，CsA)不能夠抑制CaMIT1突變株對鈣離子的敏感表型，說明鈣離子的敏感表型不是由于鈣離子信號途徑的激活而導致的。與Mille等人的報道一致，CaMIT1突變株對十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate， SDS)，對熒光增白劑(Calcofluor White， CFW)不敏感[13]；但是，CaMIT1突變株對剛果紅(Congo Red， CR)表現(xiàn)出抗性(見圖3B)。此外，我們發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對LiCl、克霉唑(Clotrimazole， Clo)、酮康唑(Ketoconazole， KCZ)以及苯胺抗真菌藥物(Anidualafungin， Anidua)表現(xiàn)為敏感表型(見圖3A、B)。LiCl溶液通常呈微堿性，但是CaMIT1突變株對堿性環(huán)境并不敏感(見圖3B)。最后，我們還發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea， HU)敏感，但對DNA損傷劑甲磺酸甲酯(Methyl Methanesulfonate， MMS)不敏感(見圖3B)。

圖2白念珠菌的CRISPR是一種有效的突變系統(tǒng)。(A)質(zhì)粒提取試劑盒提取pV1093質(zhì)粒；(B) BsmBI酶切線性化質(zhì)粒pV1093；(C) sgRCH1-F/R引物退火，并用T4 Polynucleotide kinase 在末端添加磷酸基團后得到RCH1的sgRNA寡聚核苷酸序列；(D)KpnⅠ和SacⅠ雙酶切線性化pV1093-sgRCH1質(zhì)粒；(E) PCR擴增獲得修復模板DNA；(F) 轉化獲得轉化子后，菌落PCR擴增目的片段，包含被突變位點。(G) 修復模板DNA中引入酶切位點XbaI，用限制性內(nèi)切酶XbaI對PCR產(chǎn)物進行酶切，篩選正確的轉化子

Fig.2C.albicansCRISPR is an efficient mutagenesis system. (A) Plasmid pV1093 was extracted by using plasmid extraction kit. (B) Plasmid pV1093 was linearized by digestion with BsmBI. (C) Primer of sgRCH1-F/R were annealed to obtain sgRNA oligos ofRCH1， and phosphorylated by T4 Polynucleotide kinase. (D) Plasmid pV1093-sgRCH1 was linearized by digestion withKpnIand SacI. (E) Repair DNA was obtained through PCR. (F) Colony PCR was used to amplify the flanking region including mutant site after transformation. (G) To verify correct transformants， the PCR products were subjected to digestion with the restriction enzymeXbaIwhose site was introduced during the mutagenesis

圖3 CaMIT1突變株表型.

4 討論

白念珠菌是雙倍體，傳統(tǒng)的URA-Blaster方法需要分2步才能敲除一個基因的兩個等位基因，因此基因敲除過程耗時繁瑣。而且，白念珠菌沒有已知的有絲分裂過程，自然界不存在單倍體的形態(tài)。因此，缺少簡單而快速的基因失活手段是研究白念珠菌基因功能和致病性的主要障礙。本研究通過利用Fink教授實驗室構建的應用于白念珠菌的CRISPR方法成功獲得了白念珠菌mit1/mit1純合子突變菌株。通過表型實驗，進一步驗證了mit1/mit1突變菌株的表型與Mille等人用傳統(tǒng)URA-Blaste方法構建的突變株的表型一致[13]。我們的工作進一步證明了這一技術的可行性。CRISPR這種高效簡便的基因編輯技術的應用，無疑會加速白念珠菌基因功能的研究進程。Fink教授實驗室還構建了質(zhì)粒pV1200，質(zhì)粒pV1200中的NatR標記含有翻轉酶Flippase (NATR-FLP) ，其NATR-FLP-SNR52p-sgRNA兩端含有同源序列FRT，翻轉酶可以通過同源重組的原理將NATR-FLP-SNR52p-sgRNA從基因組中刪除，因此NATR篩選標記又可被用于下個基因的敲除[16]。

此外，Mitchell教授實驗團隊已經(jīng)報道了一種短暫的CRISPR基因組編輯方法[20]。這種短暫的CRISPR編輯體系，以pV1093為模板通過PCR獲得CaCas9p表達體系，通過single-joint PCR獲得sgRNA表達體系。以pNAT為模板，用含有同源臂的引物通過PCR擴增NAT敲除盒，或者用氨基酸合成基因做篩選遺傳標記。SN148氨基酸營養(yǎng)缺陷菌株含有四種氨基酸合成基因缺失，包括URA3、HIS1、LEU2和ARG4。 Mitchell教授的短暫CRISPR基因組編輯方法證明sgRNA不需要整合到基因組上發(fā)揮作用。因此可以將CaCAS9整合到基因組上，利用PCR擴增獲得sgRNA的表達體系和氨基酸篩選標記，通過更換sgRNA和氨基酸篩選標記獲得純合子突變菌株，以及多基因突變株。

釀酒酵母ScSUR1基因是白念珠菌CaMIT1的同源基因，和釀酒酵母ScSUR1突變株細胞一樣，白念珠菌CaMIT1突變株對鈣離子敏感[21]。我們的結果表明CaMIT1突變株對鈣離子的敏感性不能夠被CsA所抑制，說明其敏感表型與鈣離子信號途徑的激活無關，我們推測是由于CaMIT1缺失導致白念珠菌細胞質(zhì)膜或者細胞壁存在缺陷造成的，這和CaMIT1突變株對SDS敏感這一表型結果一致[13]，見圖3。CFW和CR是誘發(fā)細胞壁脅迫的藥物[22]，它們都能夠與多種多聚糖物質(zhì)結合，尤其對幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖具有高親和性，這兩種染料都能夠誘導不正常的隔膜，從而導致酵母的母細胞和子細胞在細胞分裂過程中不能夠完全斷裂。我們發(fā)現(xiàn)CaMIT1突變株對CFW不敏感，而對CR表現(xiàn)出耐受性(見圖3)。CaMIT1突變株對這兩種藥物的不同表型表明這兩種染料與幾丁質(zhì)和β(1，3)-葡聚糖的結合底物可能不同。CaMIT1缺失可能導致白念珠菌細胞壁對CR的結合度下降，而沒有影響對CFW的結合度。CaMIT1突變株對破壞細胞膜通透性的抗真菌藥物Clo，KCZ和Anidualafungin表現(xiàn)出敏感性，這與CaMIT1缺突變株對SDS敏感性表型是一致的[16]。CaMIT1突變株對Li+敏感，LiCl溶液為微堿性，但是在pH8.3以及pH10.0條件下CaMIT1突變株的生長狀況和野生型細胞一致，說明CaMIT1突變株對Li+調(diào)控存在缺陷。HU和MMS都是細胞周期藥物，HU是一種DNA合成抑制劑，對S期以外的細胞無影響，但是可以阻止細胞進入S期而停留在G1/S交界(看作G1期細胞)[23]。MMS是一種烷基化試劑，是DNA損傷試劑，能夠使細胞停留在S期[24]。CaMIT1突變株對HU敏感，而對MMS不敏感，CaMIT1突變株應答HU的機制有待進一步研究。綜上所述，CaMIT1p與白念珠菌的細胞質(zhì)膜和細胞壁完整性以及鈣離子的穩(wěn)態(tài)相關。