肖 凌，毛世紅，童華榮*

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

鳳凰單叢茶屬烏龍茶類，是鳳凰水仙品種篩選出的優(yōu)異單株經單獨采摘、單獨制作得到的茶葉[1]。鳳凰單叢茶以多香型著稱，傳統(tǒng)感官品評將其分為玉蘭香、蜜蘭香、肉桂香、杏仁香、姜花香、芝蘭香、桂花香、茉莉香、黃梔香和夜來香等香型[2]。香氣是影響茶葉風味和價格的重要因素，目前對鳳凰單叢茶揮發(fā)性香氣組分的研究多采用氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術，該方法簡便高效，能對揮發(fā)性化合物進行定性定量分析[3-4]。然而，揮發(fā)性成分對香氣的貢獻不僅與含量有關，還受閾值等因素影響，GC-MS并不能確定對茶葉香氣起關鍵作用的活性香氣成分[5-6]。氣相色譜-嗅辨（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術則可將GC的分離能力與人類鼻子的靈敏性結合，通過專業(yè)評價員嗅聞，確定各化合物對香氣的貢獻，找出活性香氣成分[7-8]。目前，GC-O技術已應用于綠茶、普洱茶、烏龍茶等各類茶葉香氣成分的研究[9-12]，但鮮見在鳳凰單叢茶中應用的報道。

在對茶葉揮發(fā)性成分進行分析時，揮發(fā)性化合物的提取是其分析中的關鍵步驟，已有研究報道提取鳳凰單叢茶香氣的方法，多采用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）和頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）[4,13-15]。SDE能同時分離濃縮揮發(fā)性化合物，但樣品較長時間處于高溫高濕環(huán)境，易造成香氣成分變化[16]；HSSPME操作相對簡便，但存在萃取纖維頭吸附容量有限等問題[17]。溶劑輔助風味蒸發(fā)（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）則是一種較低溫條件下提取揮發(fā)性物質，并使提取物表現出樣品原有的自然氣味的香氣提取方法。SAFE的基本原理是利用溶劑在高真空條件下的迅速汽化，使得目標香氣物質蒸發(fā)，與難揮發(fā)物質[18]分離，隨后通過液氮將揮發(fā)性成分冷凍下來。已有研究對比了三者提取效果，發(fā)現SAFE對風味成分的破壞更小，熱敏性物質損失更少[19-20]。目前，已見SAFE運用于紅茶和綠茶揮發(fā)性成分提取分析中[21-23]，但鮮見在鳳凰單叢茶中的應用報道。

本研究采用SAFE提取3 種不同香型鳳凰單叢茶揮發(fā)性成分，并結合GC-MS和GC-O對其組分進行定性定量分析，找出活性香氣成分，比較不同香型間的成分差異，為進一步探究鳳凰單叢茶香型劃分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種香型鳳凰單叢茶樣品為2016年春季茶，產于廣東省潮安縣鳳凰鎮(zhèn)鳳凰山。樣品由專家按照傳統(tǒng)感官品評分別定義為玉蘭香、蜜蘭香和桂花香3 種香型。

正構烷烴混合標品（C7～C30） 美國Supelco公司；癸酸乙酯（純度＞99%）、α-蒎烯（98%） 美國Sigma公司；己醛（98%）、乙酸丁酯（＞99%）、乙基苯（99%）、環(huán)己酮（＞99%）、己酸（99%）、異佛爾酮（＞98%）、正辛醇（99%）、芳樟醇（＞98%）、順-3-己烯基丁酯（＞98%）、癸醛（97%）、橙花醇（＞98%）、己酸戊酯（＞98%）、（Z）-己酸-3-己烯酯（＞99%）、順式茉莉酮（＞95%）、十二醇（98%）、β-紫羅酮（＞96%）、月桂酸甲酯（＞98%）、二氫獼猴桃內酯（＞98%）、橙花叔醇（＞95%）、肉豆蔻酸甲酯（＞98%） 中國Adamas公司；γ-丁內酯（＞99%）、α-松油烯（＞90%）、環(huán)氧芳樟醇（98%）、二乙二醇丁醚（＞98%）、香葉醇（96%）、β-石竹烯（＞90%）、α-紫羅酮（＞90%） 日本TIC株式會社；二氯甲烷（色譜純） 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

QP2010Plus GC-MS聯用儀、2010ATF GC儀 日本Shimadzu公司；Sniffer 9000嗅辨儀 瑞士Brechbühler公司；Q-Gard 1超純水發(fā)生器 美國Millipore公司；FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造公司；SAFA裝置（定制） 日本Kiriyama制作所；EXT75DX渦輪分子真空泵 英國Edwards公司；HB10旋轉蒸發(fā)儀 德國IKA公司；HSC-24A氮吹儀 天津恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

按照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》中的烏龍茶（蓋碗審評法），由6 名具豐富審評經驗的評茶師對樣品的外形、湯色、香氣、滋味、葉底進行審評，單獨打分，取平均值為最終結果，加權計算總分，香氣評語由6 人討論得出。

1.3.2 SAFE提取茶葉揮發(fā)性成分

精確稱取10.000 g粉碎后的茶樣（過40 目篩），置于100 mL具塞錐形瓶，加入40 mL二氯甲烷萃取3 h，倒出提取液后加入30 mL二氯甲烷萃取13 h，再次倒出提取液后加入30 mL二氯甲烷萃取1 h，萃取在室溫條件下進行，3 次萃取完成后，合并提取液，過濾。將濾液轉移至SAFE裝置（圖1[18]）滴液漏斗中，準確加入100 μL質量濃度為86.50 mg/L的癸酸乙酯內標物，恒溫水浴溫度為40 ℃，在冷阱和保溫瓶中加入液氮，真空泵使系統(tǒng)壓力降至5×10-3Pa，打開滴液漏斗，使溶液緩慢滴入蒸餾燒瓶中，約30 min完成SAFE萃取。接收瓶中的萃取液被旋蒸濃縮至2 mL左右，再氮吹至0.2 mL，封口置于-40 ℃冰箱備用。

圖1 SAFE裝置示意圖Fig. 1 Schematic of the SAFE equipment

1.3.3 GC-MS分析

G C條件：色譜柱為D B-5 M S石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；柱箱升溫程序：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min升至130 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持3 min；載氣為氦氣（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣模式不分流。

MS條件：電子電離源；碰撞能量70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲時間4 min；質量掃描范圍m/z 40～400。

定性定量分析：運用NIST 08s譜庫檢索GC-MS分析得到的數據，保留匹配度大于70的成分。通過各色譜峰的保留指數與文獻中的保留指數對比定性。各組分的保留指數由其保留時間和相鄰正構烷烴的保留時間計算得到[24]。對鳳凰單叢茶香氣品質形成有重要作用的揮發(fā)性物質通過標準品進一步定性。根據各組分色譜峰面積與癸酸乙酯內標物的峰面積之比進行定量[25-26]。運用Excel計算香型相似率[27]。

1.3.4 GC-O分析

GC條件：色譜柱為RTX-5石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；氫火焰離子檢測器溫度260 ℃；載氣為氮氣（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量300 mL/min；尾吹流量30 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣模式不分流；柱箱升溫程序與GC-MS條件一致。

嗅聞條件：GC柱末端分別接氫火焰離子檢測器和Sniffer 9000嗅辨儀，分流比為1∶1。GC與嗅辨儀間的傳輸線為內部石英外加不銹鋼質加熱保溫管線（80 cm×0.25 mm），加熱溫度250 ℃，GC流出物經過空氣加濕器流至嗅聞口，Humid Air加濕速率為19.5 mL/min。

選擇2 名有經驗的感官評價員進行鳳凰單叢茶嗅聞分析，每人經過至少10 h的正規(guī)嗅聞分析訓練。嗅聞過程中，評價員需要描述氣味物質的香氣特征，記錄保留時間，并對其強度打分。香氣強度采用4 點刻度法：0表示未聞到、1表示微弱、2表示中等、3表示較強、4表示極強[28-29]。對同一樣品，每人做2 次平行測定，共4 份數據用于統(tǒng)計分析。同一時段至少有2 次及以上的相似氣味描述記錄，則將該組分判定為活性香氣成分，其香氣強度值為4 次記錄的平均值。

2 結果與分析

2.1 鳳凰單叢茶感官審評

烏龍茶香氣品質以品種特征明顯，花香、果香濃郁，香氣優(yōu)雅純正為優(yōu)。3 種實驗樣品的評價結果如表1所示，桂花香茶品質最為突出，香氣得分為94 分，高于玉蘭香茶和蜜蘭香茶，且香氣呈現明顯桂花香特征。從評語看出不同香型茶的香氣各有特點，這可能與茶樹品種差異、加工工藝不同有關[13]。

表1 鳳凰單叢茶感官審評結果Table 1 Results of sensory evaluation of Fenghuang Dancong tea

2.2 鳳凰單叢茶揮發(fā)性成分鑒定及香型相似率比較

3 種香型鳳凰單叢茶經SAFE法提取，GC-MS分析，共分離鑒定出91 種揮發(fā)性化合物，其中玉蘭香茶65 種、蜜蘭香茶53 種、桂花香茶71 種，共有成分38 種，如表2所示。38 種共有揮發(fā)性成分包括13 種碳氫化合物、10 種醇類、6 種酮類、5 種酯類、3 種醛類和1 種內酯類化合物，平均相對含量較高的10 種組分分別為二氫獼猴桃內酯、橙花叔醇、環(huán)氧芳樟醇、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、β-紫羅酮、棕櫚酸甲酯、己醛、橙花醇和十六烷。如表3所示，玉蘭香茶與蜜蘭香茶間差異較小，相似率為83.56%，桂花香茶與玉蘭香茶、蜜蘭香茶間差異較大，相似率分別為61.29%、71.64%。

表2 鳳凰單叢茶揮發(fā)性成分鑒定結果Table 2 Identification of volatile compounds of Fenghuang Dancong tea

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 3 種鳳凰單叢茶香型相似率比較Table 3 Comparison in aroma similarity among 3 Fenghuang Dancong teas%

2.3 不同香型鳳凰單叢茶揮發(fā)性成分比較

表4 3 種香型鳳凰單叢茶揮發(fā)性成分比較Table 4 Comparison of the number of volatile compounds from each chemical class in three types of Fenghuang Dancong tea

如表2、4所示，桂花香茶鑒定出的組分最多，達到71 種，相對含量較高的組分為二氫獼猴桃內酯（5.43%）、橙花叔醇（2.90%）、環(huán)氧芳樟醇（2.71%）、2,6-二甲基環(huán)己醇（2.02%）、β-紫羅酮（1.94%）；玉蘭香茶鑒定出65 種組分，相對含量較高的有橙花叔醇（5.99%）、二氫獼猴桃內酯（4.31%）、環(huán)氧芳樟醇（2.72%）、芳樟醇氧化物I（2.03%）、乙二醇單丁醚（1.84%）；蜜蘭香茶鑒定出53 種組分，相對含量較高的為二氫獼猴桃內酯（4.77%）、橙花叔醇（3.41%）、芳樟醇氧化物I（2.59%）、環(huán)氧芳樟醇（2.29%）、甲基庚烯酮（2.18%）。3 種茶樣所含組分均以碳氫化合物的種類最多，醇類次之。如圖2所示，醇類為3 種茶樣中相對含量最高的物質，碳氫化合物、酮類以及酯類物質的含量也較高，但各香型間存在明顯差異。

圖2 3 種香型鳳凰單叢茶揮發(fā)性組分相對含量對比圖Fig. 2 Comparison of the relative contents of different chemical classesof volatile compounds in three types of Fenghuang Dancong tea

玉蘭香茶、蜜蘭香茶和桂花香茶所含醇類化合物的相對含量分別為18.53%、14.82%和18.33%。橙花叔醇、橙花醇、芳樟醇及其氧化物是主要的共有成分，它們都呈現愉快的花果香氣，這些物質也是單叢茶中最為常見、含量豐富的香氣組分[13-15]。玉蘭香茶檢測出13 種醇類，蜜蘭香茶測出12 種，二者醇類物質組成較為相似；桂花香茶檢測出18 種醇類，2,6-二甲基環(huán)己醇（2.02%）、具有極好花果香的脫氫芳樟醇（1.71%）、具有花香的十二醇（0.51%）、橙花醇氧化物（0.48%）和香葉基芳樟醇（0.30%）都只在桂花香茶中檢出。

玉蘭香茶的碳氫化合物相對含量為14.20%，高于蜜蘭香茶和桂花香茶的13.01%、11.61%。飽和烷烴幾乎不呈現香氣，不飽和烴對單叢茶葉香氣起重要作用[30]。呈花香的（-）-檸檬烯和具有芳香氣味的乙基苯是共有成分中相對含量較高的物質，在玉蘭香、蜜蘭香、桂花香單叢茶中相對含量分別為1.25%和1.17%、1.16%和1.03%、0.87%和1.06%。具有松木及樹脂樣氣味的α-蒎烯在蜜蘭香茶和桂花香茶中檢出；具有草香、花香的羅勒烯在玉蘭香茶和桂花香茶中檢出；有柑橘和檸檬似香氣的α-松油烯僅在桂花香茶中檢出。

玉蘭香茶、蜜蘭香茶和桂花香茶的酮類化合物相對含量分別為7.92%、10.28%和13.70%。2,2,6-三甲基環(huán)己酮、呈木香和紫羅蘭香味的β-紫羅酮和α-紫羅酮是主要的共有成分。具有果香、清香的甲基庚烯酮在玉蘭香茶和蜜蘭香茶中檢出，相對含量分別為1.76%和2.18%，是2 種茶樣中相對含量最高的酮類物質；似茉莉花香的順式茉莉酮是桂花香茶獨有的酮類化合物，相對含量僅次于β-紫羅酮，達1.86%。

桂花香茶的酯類化合物相對含量為9.79%，高于玉蘭香茶和蜜蘭香茶的6.09%、5.08%。有些酯類成分，如油酸甲酯、亞油酸甲酯等，它們由高級脂肪酸和低級醇脫水縮合而成，沒有氣味，對茶葉香氣形成幾乎沒有作用[30]。呈果香的順-3-己烯基丁酯在玉蘭香茶和蜜蘭香茶中相對含量分別為1.52%、1.44%，是2 種茶樣中相對含量最高的酯類化合物，但在桂花香茶中沒有檢出；具有蜂蜜香氣的肉豆蔻酸甲酯和具有花香、酒香的月桂酸甲酯是桂花香茶特有的香氣物質，相對含量分別為1.70%、1.18%；呈果香的（Z）-己酸-3-己烯酯在玉蘭香茶和桂花香茶中檢出，相對含量分別為0.80%和0.47%。

在3 種單叢茶中共檢出4 種內酯類化合物，帶香豆素樣氣息的二氫獼猴桃內酯是3 種茶的共有成分，在玉蘭香茶、蜜蘭香茶和桂花香茶中的相對含量分別為4.31%、4.77%、5.43%。有類似酯氣味的2-乙酰基丁內酯和有獨特芳香氣味的γ-丁內酯在玉蘭香茶中檢出；具有奶油、果香的茉莉內酯在桂花香茶中檢出。

3 種單叢茶共檢出4 種醛類化合物，呈青草氣的己醛、具有薄荷香氣的β-環(huán)檸檬醛和有脂蠟香的癸醛是3 種茶的共有醛類成分，玉蘭香茶和蜜蘭香茶還檢出呈特殊脂蠟香的2-甲基十一醛。此外，在3 種茶樣中還檢測出少量的醚類、酸類、苯酚類和吡嗪類化合物。

2.4 鳳凰單叢茶活性香氣成分分析

表5 鳳凰單叢茶活性香氣成分鑒定結果Table 5 Identi fi cation of aroma-active compounds of Fenghuang Dancong tea

如表5所示，通過GC-O共嗅聞出31 種香氣化合物，其中30 種被鑒定，另外1 種未知物有待進一步研究。嗅聞到鳳凰單叢茶的香氣特點，包括青氣、土腥味、油脂味、木香、花香、果香、甜香、奶香、清香、焙烤香、焦糖香、豆香、松香、蜜香、臭味等，其中以花香、甜香、清香、果香為主。玉蘭香茶嗅聞出23 種活性香氣成分，鑒定出22 種，強度大于2 分的成分為庚醛、己醛、α-松油烯、芳樟醇、橙花醇；蜜蘭香茶嗅聞出24 種活性香氣成分，鑒定出23 種，強度在2 分以上的成分為橙花醇、己醛、庚醛、香葉基丙酮、月桂酸甲酯；桂花香茶嗅聞出26 種活性香氣成分，鑒定出25 種，強度大于2 分的成分為己醛、α-松油烯、橙花醇、庚醛、芳樟醇、β-石竹烯。

庚醛在3 種茶樣中都被GC-O檢出，且強度都在2 分以上，但并未被GC-MS檢出，這很可能是因為其閾值較低（3 μg/L）[31]。己醛同樣在3 種茶樣中都被嗅聞出，強度均在2 分以上，呈現強烈的青草氣味。具有果香、橘子味的α-松油烯在玉蘭香茶和桂花香茶中強度大于2 分，在蜜蘭香茶中強度為1.25 分。通過GC-MS檢測出的相對含量較高的橙花叔醇、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II和橙花醇都在GC-O分析中被嗅聞出來，且在3 種茶樣中強度得分均高于1 分，這4 種化合物都呈現愉快的香氣，以花香、甜香、果香為主，對鳳凰單叢茶典型花果蜜香的香氣特征的形成貢獻較大，且橙花叔醇香氣持久，是單叢茶耐沖泡的原因之一[4]。芳樟醇是茶葉中常見的揮發(fā)性成分，由糖苷前體水解生成，GC-O嗅聞呈現花香、清香，強度均大于1 分。α-紫羅酮和β-紫羅酮是類胡蘿卜素降解形成的酮類物質，在3 種茶樣中都被GC-O嗅聞出木香的特征。通過GC-O嗅聞出清香、甜香特征的香葉基丙酮和花香特征的順式茉莉酮在3 種茶樣中強度均大于1 分，二者也是烏龍茶中常見的香氣成分。

通過感官審評和相似率比較發(fā)現，桂花香茶的香氣特征最為突出。GC-MS結果顯示脫氫芳樟醇是桂花香茶獨有成分，且相對含量較高（1.71%），其在GC-O分析中的嗅聞強度為1.50分，報道稱脫氫芳樟醇在烘焙時隨時間延長而明顯增加，因而花果香顯著[13]，對形成桂花香獨有香氣品質有積極作用。呈清香的β-石竹烯和呈甜香、奶香的二氫獼猴桃內酯在桂花香茶中的嗅聞強度也明顯高于玉蘭香茶和蜜蘭香茶，很可能是桂花香茶的關鍵賦香物質。

GC-MS是用于鳳凰單叢茶香氣分析的重要技術，但其檢測出的揮發(fā)性成分有的不呈現氣味，有的成分閾值太高，無法被人嗅聞到，并不是所有組分都對鳳凰單叢茶香氣形成有貢獻，只有一部分成分有助于茶葉整體香氣形成[32]。將GC-O與GC-MS結合運用能夠有效分離鑒定出揮發(fā)性組分中的活性香氣成分[33]。茶葉的香氣品質形成十分復雜，它并不是單一成分在起作用，而是各香氣成分按一定比例組合的綜合體現[4]，并不是GC-O嗅聞強度值高的物質就一定對香氣貢獻最大。后續(xù)研究將運用外標法對單叢茶中的活性香氣成分準確定量，進行香氣重組實驗和遺漏實驗，進一步探究活性香氣成分對整體香型的貢獻。

3 結 論

本研究采用SAFE法對3 種香型鳳凰單叢茶進行揮發(fā)性成分提取，通過GC-MS共分離鑒定出91 種成分，以醇類、酮類、碳氫化合物為主，共有成分38 種。玉蘭香茶鑒定出65 種揮發(fā)性成分，相對含量較高的為橙花叔醇、二氫獼猴桃內酯、環(huán)氧芳樟醇、芳樟醇氧化物I、乙二醇單丁醚；蜜蘭香茶鑒定出53 種，相對含量較高的為二氫獼猴桃內酯、橙花叔醇、芳樟醇氧化物I、環(huán)氧芳樟醇、甲基庚烯酮；桂花香茶鑒定出71 種，相對含量較高的為二氫獼猴桃內酯、橙花叔醇、環(huán)氧芳樟醇、2,6-二甲基環(huán)己醇、β-紫羅酮。進一步結合GC-O分析，共從3 種鳳凰單叢茶中嗅聞出31 種活性香氣成分，鑒定出30 種，香氣特點以花香、甜香、清香、果香為主。橙花醇、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II和橙花叔醇在3 種茶樣中相對含量豐富，嗅聞強度值較高，且嗅聞呈愉快的花果香氣，對鳳凰單叢茶香氣品質形成有重要作用。