楊 蕾，王柏輝，羅玉龍，王 宇，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

脂肪具有儲存甘油三酯并釋放脂肪酸的作用，被認(rèn)為是改善羊肉品質(zhì)和影響羊肉風(fēng)味的重要物質(zhì)。在脂肪組織中硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）、脂肪酸脫氫酶Ⅰ（Δ5-fatty acid desaturases，F(xiàn)ADS1）、脂肪酸脫氫酶Ⅱ（Δ6-fatty acid desaturases，F(xiàn)ADS2）、脂肪酸延長酶（elongase of very long chain fatty acid 5，Elove5）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（carnitine palmitoyltransferase I，CPT1）、脂肪酸結(jié)合蛋白酶（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）是影響脂肪合成和分解的關(guān)鍵酶。近年來，大量的研究表明，調(diào)控飼養(yǎng)方式對脂肪酸組成和脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)有一定影響[1-3]。有研究結(jié)果表明不同飼養(yǎng)方式對羊肉中LPL、ACC、FABP4、CPT1和SCD基因表達(dá)量以及脂肪酸組成和含量均有影響[4-5]。Meadus等[6]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加共軛亞油酸可以影響PPARγ基因的表達(dá)，從而促進肌內(nèi)脂肪的沉積。

蘇尼特羊作為內(nèi)蒙古獨特的優(yōu)良羊種，原產(chǎn)于錫林郭勒盟，含蛋白高且膻味輕，并且富含人體所需的各種氨基酸和脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)價值[7]。羅玉龍[8]、郭月英[9]、蘇琳[10]等主要對蘇尼特羊肉中風(fēng)味物質(zhì)、生長特性相關(guān)基因和肌纖維的種類分布等方面進行研究，但對于影響蘇尼特羊肉中營養(yǎng)成分的因素，特別是對肉中不飽和脂肪酸種類與含量的研究相對較少。本實驗采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法研究飼養(yǎng)方式對脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響，同時分析不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達(dá)量的差異性，以期從分子生物學(xué)的角度解釋放牧和圈養(yǎng)兩種飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊脂肪組織中脂肪和脂肪酸的沉積機理，為改善圈養(yǎng)條件下蘇尼特羊肉品質(zhì)和風(fēng)味提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣巴美肉羊種園區(qū)選取放牧和圈養(yǎng)條件下12 月齡的蘇尼特羊各10 只（公母各5 只），宰前絕食20 h，屠宰后，取肌內(nèi)脂肪、尾脂和腎脂各約10 g，于液氮中保存，并轉(zhuǎn)移到實驗室置于-80 ℃冰箱下保藏待用。

氯仿、異丙醇、無水乙醇（均為分析純）、RNase-free水北京天根生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；核酸染料 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯 Intrivogen公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq?Version2.0、PremeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C超凈臺 上海智城分析儀器制造有限公司；5430R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；水平電泳槽、凝膠成像分析儀、CFX96TMReal-Time PCR儀 美國Bio-Rad公司；普通PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設(shè)計與合成

SCD、FADS1、FADS2、LPL、ACC、CPT1、PPARγ、Elove5、FABP4由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，β-actin作為管家基因（表1）。

表 1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

稱取50～100 mg的樣品放入經(jīng)液氮冷卻的研缽中，并不斷加入液氮研磨樣品至細(xì)粉末狀用于RNA提取，提取參照參考文獻(xiàn)[11]，得到RNA后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖膠點樣并電泳檢測提取的總RNA的質(zhì)量與質(zhì)量濃度。

將所有RNA樣品稀釋為統(tǒng)一質(zhì)量濃度500 ng/μL。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）兩步法將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄過程參照參考文獻(xiàn)[11]，反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA質(zhì)量濃度默認(rèn)為50 ng/L，在-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時熒光定量PCR

本實驗按照CFX96TMReal-Time PCR Detection System的二步法進行操作。以上述所合成的cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII（TLi RNaseH Plus）試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增[12]。

熒光實時定量PCR體系（25.0 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTMII（TLi RNaseH Plus） 12.5 μL、引物F 1.0 μL、引物R 1.0 μL、cDNA模板2.0 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL。

實時熒光定量PCR條件：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火，各引物對應(yīng)時間30 s，延伸72 ℃、30 s（變性、退火和延伸35 個循環(huán)）；延伸72 ℃，10 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗實驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，差異性分析采用雙因素方差分析（Two way-ANOVA）進行LSD多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析（Pearson），檢測相關(guān)水平為r＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對脂肪代謝基因表達(dá)量的影響

2.1.1 脂肪酸脫氫酶

由圖1可知，不同飼養(yǎng)方式對脂肪組織中脂肪酸脫氫酶基因（SCD、FADS1、FADS2和Elove5）表達(dá)量均有影響。在圈養(yǎng)條件下，SCD基因在脂肪組織中表達(dá)量顯著高于放牧條件（P＜0.05）。由于SCD基因主要促進油酸的合成[13]，在脂肪合成過程中，油酸更容易成為?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶和二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶合成底物，從而生成膽固醇酯和甘油三酯，而這兩者是動物體內(nèi)最主要的中性脂成分[14]，SCD基因在放牧組脂肪中的表達(dá)量顯著低于圈養(yǎng)組，因此推斷放牧條件不利于脂肪的合成。卜登攀等[15]證明在飼料中添加亞麻酸對SCD基因表達(dá)具有抑制作用，同時有研究證明牧草中含有較多的亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸[16]，因此牧草中高含量的亞麻酸可能是抑制放牧組SCD基因表達(dá)的原因之一。

圖 1 飼養(yǎng)方式對不同脂肪組織中脂肪酸脫氫酶基因表達(dá)量的影響Fig. 1 Effects of two different feeding patterns on the expression of fatty acid desaturase gene in different adipose tissues

放牧條件下，脂肪組織中FADS1、FADS2和Elove5基因表達(dá)量高于圈養(yǎng)條件，特別在放牧組肌內(nèi)脂肪中這3 種基因的表達(dá)量顯著高于圈養(yǎng)組（P＜0.05）。這與Urrutia等[17]對羔羊日糧中添加亞油酸的研究結(jié)果一致，在飼料中添加亞油酸對腎脂和尾脂中FADS1、FADS2和Elove5基因表達(dá)量未產(chǎn)生顯著影響，但可以促進肌內(nèi)脂肪中FADS1和FADS2基因表達(dá)，從而可能使肌內(nèi)脂肪中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不飽和脂肪酸的沉積。

2.1.2 脂肪合成調(diào)節(jié)酶

圖 2 飼養(yǎng)方式對不同脂肪組織中脂肪合成分解酶基因表達(dá)量的影響Fig. 2 Effects of two different feeding patterns on the expression of fat decomposition and synthesis enzyme genes in different adipose tissues

如圖2所示，不同飼養(yǎng)方式對脂肪合成分解酶基因（ACC和LPL）表達(dá)量有顯著影響。在不同飼養(yǎng)方式下，脂肪組織中ACC基因的表達(dá)量均無顯著差異（P＞0.05）。ACC是脂肪酸合成的限速酶，參與催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)[18]，楊若琳等[19]研究發(fā)現(xiàn)ACC活力大小與脂肪酸含量的高低有很大關(guān)系，說明ACC基因的高表達(dá)有利于脂肪酸的沉積，可推測出不同飼養(yǎng)方式對脂肪組織中脂肪酸沉積無影響。研究發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)對肌肉組織ACC基因表達(dá)量的影響為顯著高于放牧組[4]，與本實驗結(jié)果存在差異，可能由于不同品種間ACC基因的表達(dá)有差異。

LPL能夠?qū)⒀褐腥槊游⒘：蜆O低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有關(guān)組織提供合成甘油三酯所需的原料，對脂肪沉積起著重要的調(diào)控作用[20]，其活力的高低是評價脂肪儲積能力的重要指標(biāo)之一[21]，放牧條件下，脂肪組織中LPL的表達(dá)量高于圈養(yǎng)條件，在尾脂和腎脂中放牧組顯著高于圈養(yǎng)組（P＜0.05）；因此推測放牧條件有助于脂肪組織中脂肪的沉積，特別是對脂肪儲存影響較大。

2.1.3 脂肪酸轉(zhuǎn)移酶和調(diào)控因子

圖 3 飼養(yǎng)方式對不同脂肪組織中CPT1和FABP4基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of two different feeding patterns on the expression of CPT1 and FABP4 in different adipose tissues

由圖3可知，不同飼養(yǎng)方式對脂肪組織中脂肪酸轉(zhuǎn)移酶基因（FABP4和CPT1）表達(dá)量有影響。放牧條件下，肌內(nèi)脂肪組織中CPT1基因的表達(dá)量高于圈養(yǎng)條件，但差異不顯著（P＞0.05），有研究表明日糧中亞油酸的含量與CPT1基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[22]，可以推測牧草中亞油酸的含量是導(dǎo)致放牧組肌內(nèi)脂肪組織中CPT1高表達(dá)的原因之一。放牧條件增加FABP4基因在脂肪組織中表達(dá)量，但差異不顯著（P＞0.05），這與Dervishi等[4]的研究結(jié)果一致。

圖 4 飼養(yǎng)方式對不同脂肪組織中PPARγ基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effects of two different feeding patterns on the expression of PPARγ in different adipose tissues

如圖4可知，放牧條件下可增加肌內(nèi)脂肪和尾脂中PPARγ基因在脂肪組織中的表達(dá)量，但差異不顯著。PPARγ具有脂肪組織特異性，能被脂肪酸和外源性過氧化氫酶增殖劑激活，從而調(diào)控脂質(zhì)代謝酶的表達(dá)[21]，它和SREBP1促進甘油三酯合成脂肪組織，是調(diào)控脂肪生成的關(guān)鍵酶之一[23]，也有研究證明PPARγ基因的表達(dá)與脂肪沉積率呈正相關(guān)[24]，由此得出，放牧組蘇尼特羊脂肪組織中脂肪沉積可能會高于圈養(yǎng)組，但對肌內(nèi)脂肪的沉積沒有明顯影響。

2.2 不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達(dá)量差異性分析

由表2可知，不同脂肪組織間脂肪代謝基因表達(dá)量存在顯著差異。在尾脂中SCD和ACC的表達(dá)量顯著高于肌內(nèi)脂肪和腎脂（P＜0.05），SCD和ACC基因的高表達(dá)量有助于脂肪的沉積，因此導(dǎo)致兩種基因在尾脂中的表達(dá)量顯著高于其他兩種脂肪組織。在肌內(nèi)脂肪中FADS1和FADS2基因表達(dá)量顯著高于尾脂和腎脂（P＜0.05），這2 種酶是生成長鏈不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，因此可以證明在同一機體中肌肉是營養(yǎng)價值較高的部位。Elove5基因在背最長肌中的表達(dá)量顯著高于尾脂（P＜0.05）。在腎脂中LPL基因的表達(dá)量顯著高于肌內(nèi)脂肪（P＜0.05），有研究發(fā)現(xiàn)LPL基因表達(dá)量在不同部位存在差異且在肌內(nèi)脂肪中表達(dá)量低于其他脂肪組織[17,25]，LPL基因在腎脂中表達(dá)量最高，其次為尾脂中，在肌內(nèi)脂肪中表達(dá)量最低，本實驗結(jié)果驗證了這一結(jié)論。

表 2 不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達(dá)量差異性分析Table 2 Differential analysis of fat metabolism genes expression in different adipose tissues

不同脂肪組織中脂肪酸轉(zhuǎn)移酶和調(diào)控因子的基因表達(dá)存在顯著差異。肌內(nèi)脂肪中FABP4基因表達(dá)量顯著低于其他兩個部位（P＜0.05）。FABP4基因作為脂質(zhì)積累調(diào)控的下游關(guān)鍵基因，其高表達(dá)量有助于脂肪沉積[26]，推斷其在肌內(nèi)脂肪中的表達(dá)量顯著降低，本實驗驗證了這一推斷。CPT1基因在肌內(nèi)脂肪中表達(dá)量顯著高于尾脂和腎脂（P＜0.05），張艷芳[27]發(fā)現(xiàn)豬肉CPT1基因的高表達(dá)有利于肌內(nèi)脂肪的沉積，本研究中放牧組蘇尼特羊肌內(nèi)脂肪中的CPT1基因mRNA表達(dá)量較高，可以推斷放牧條件有利于蘇尼特羊肌肉中脂肪的沉積。PPARγ基因在尾脂和腎脂中的表達(dá)量顯著高于肌內(nèi)脂肪（P＜0.05），大小為尾脂＞腎脂＞肌內(nèi)脂肪。林婄婄等[28]研究發(fā)現(xiàn)PPARγ基因在淺層脂肪組織（尾脂、皮下脂肪）中的表達(dá)量低于深層脂肪組織，并推測因淺層脂肪組織儲存大量的脂肪從而使PPARγ基因在尾脂和皮下脂肪組織中表達(dá)量較高，本實驗驗證了這一結(jié)論。

2.3 脂肪酸代謝基因間mRNA水平相關(guān)性分析

由表3～5可知，脂肪組織中脂肪酸脫氫酶與脂肪合成分解酶基因的mRNA基因表達(dá)量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ACC與SCD基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P＞0.05）。說明了當(dāng)ACC高表達(dá)時促進了SCD基因表達(dá)量的升高，使脂肪組織中單不飽和脂肪酸的含量增加。LPL是脂肪分解的關(guān)鍵酶，這些酶通過調(diào)控體內(nèi)甘油三酯的水解，來降低體脂合成和沉積，并促進脂肪酸的氧化[29]。本實驗結(jié)果表明，當(dāng)LPL基因表達(dá)量高時會抑制SCD基因表達(dá)，使機體中脂肪含量降低同時降低脂肪組織中單不飽和脂肪酸含量。

對脂肪酸脫氫酶與脂肪酸轉(zhuǎn)移酶和調(diào)控因子相關(guān)性分析中，脂肪組織中FADS1和FADS2與CPT1和FABP4基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05），F(xiàn)ABP4作為膜周邊蛋白，分子中心有高親和力的長鏈脂肪酸結(jié)合位點，能可逆地與長鏈脂肪酸以非共價結(jié)合，參與飽和及不飽和長鏈脂肪酸的代謝和轉(zhuǎn)運[30]，當(dāng)FABP4基因的表達(dá)量高時會抑制FADS1和FADS2基因表達(dá)，不利于長鏈脂肪酸的沉積；因此通過調(diào)控FABP4基因的表達(dá)促進脂肪組織中長鏈脂肪酸的沉積還需進一步研究。在肌內(nèi)脂肪中FADS1和FADS2與PPARγ基因表達(dá)存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），PPARγ作為脂肪沉積的重要的調(diào)節(jié)因子，其高表達(dá)正向調(diào)控FADS1和FADS2基因的表達(dá)量，使羊肉中肌內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸沉積，從而改善羊肉嫩度和營養(yǎng)價值；在尾脂和腎脂中FADS1和FADS2與PPARγ基因表達(dá)量負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05），與上述肌內(nèi)脂肪相關(guān)性分析得到的結(jié)果相反，推測基因在不同部位中的表達(dá)可能存在差異。

表 3 肌內(nèi)脂肪中脂質(zhì)代謝基因mRNA表達(dá)量的相關(guān)性Table 3 Correlation of lipid metabolism genes in intramuscular adipose tissues

表 4 尾脂中脂質(zhì)代謝基因mRNA表達(dá)量的相關(guān)性Table 4 Correlation of lipid metabolism genes in tail adipose tissues

表 5 腎脂中脂質(zhì)代謝基因mRNA表達(dá)量的相關(guān)性Table 5 Correlation of lipid metabolism genes in perirenal adipose tissues

3 討 論

本實驗通過實時熒光定量PCR分析不同飼養(yǎng)方式下脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)量的差異，得到放牧組LPL基因在尾脂和腎脂中的表達(dá)量顯著高于圈養(yǎng)組（P＜0.05），因此放牧條件更有利于儲能脂肪的沉積。圈養(yǎng)組SCD基因表達(dá)量顯著高于放牧組（P＜0.05），表明圈養(yǎng)方式有利于促進油酸的合成，Nuernberg等[31]驗證了這一結(jié)果。對飼養(yǎng)方式影響脂肪組織中脂肪酸含量和種類的研究發(fā)現(xiàn)放牧方式有利于多不飽和脂肪酸的沉積[31-33]，本實驗得出放牧組中FADS1、FADS2和Elove5基因表達(dá)量顯著高于圈養(yǎng)組（P＜0.05），可以證明放牧方式有利于亞麻酸、DHA和EPA的沉積的原因之一是脂肪酸脫氫酶基因的高表達(dá)。

通過不同脂肪組織間脂肪代謝相關(guān)基因mRNA基因表達(dá)量差異性分析發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)脂肪中FADS1和FADS2的基因表達(dá)量顯著高于其他兩組（P＜0.05），研究發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪有利于C18:2、C18:3、C20:5和C20:6的沉積[33]，實驗結(jié)果與上述結(jié)論一致。PPARγ基因在尾脂和腎脂中的表達(dá)量顯著高于肌內(nèi)脂肪（P＜0.05），由高到低依次為尾脂＞腎脂＞肌內(nèi)脂肪，說明蘇尼特羊尾脂的合成強度明顯高于其他兩個脂肪組織，這一結(jié)論完全符合肉羊中脂肪沉積規(guī)律，即皮下脂肪最先沉積，接著是尾部脂肪和內(nèi)臟貯脂，最后沉積于肌肉內(nèi)[34]。

脂肪代謝基因間相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在蘇尼特羊脂肪組織中，通過調(diào)控SCD基因的表達(dá)量可以調(diào)節(jié)脂肪的沉積。CPT1和FABP4基因的高表達(dá)量有利于脂肪組織中EPA和DHA的沉積。在尾脂和腎脂中PPARγ基因的高表達(dá)不利于C18:2和C18:3的沉積。以上研究都證明采用分子生物學(xué)的手段調(diào)控基因表達(dá)對脂肪和脂肪酸的沉積有顯著影響。由此可知，飼養(yǎng)方式會影響脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進而調(diào)控脂肪沉積。目前為適應(yīng)生態(tài)與畜牧業(yè)發(fā)展雙贏的目標(biāo)，內(nèi)蒙古、新疆和青海等地羊養(yǎng)殖方式由傳統(tǒng)放牧散養(yǎng)到集中圈養(yǎng)是大勢所趨，如何在圈養(yǎng)條件下控制羊的運動量、改變飼料營養(yǎng)水平，從而改善舍飼羊的肉用品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)是未來的研究核心和方向。