趙媛，劉偉，趙一賀，宋廣平，李代紅（天津市第一中心醫(yī)院輸血科，天津 300192）

ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)，除常見的ABO表型外，還有一類與正常ABO血型抗原結(jié)構(gòu)、性能或抗原位點數(shù)有一定差異的亞型存在。亞型也有遺傳基礎(chǔ)，也具有明確的血清學(xué)特點［1］。例如：Bx亞型紅細(xì)胞與單克隆抗-B呈弱凝集，甚至不凝集；與抗-AB弱凝集～2+凝集；H抗原表達(dá)近似于O型紅細(xì)胞；血清中常伴有不規(guī)則抗B抗體，當(dāng)抗體較強(qiáng)時極易誤診為O型；ABO亞型的誤診對臨床輸血安全、器官移植、骨髓移植、法醫(yī)學(xué)鑒定、新生兒溶血病造成嚴(yán)重危害。1990年首次通過基因測序明確了人類ABO血型系統(tǒng)中A1、B、O三個主要等位基因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，分子生物學(xué)逐步應(yīng)用到人類血型鑒定。目前，被dbRBC NCBI血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫收集的Bx等位基因有12個，其分子機(jī)制均為點突變［2］。本文總結(jié)1例血清學(xué)極易誤診的Bx亞型伴有較強(qiáng)抗B抗體標(biāo)本，結(jié)合分子生物學(xué)基因分型測序分析報道如下。

1 臨床資料

1.1 對象：先證者，男，39歲，漢族，大面積燒傷急診入院進(jìn)行ABO血型鑒定時，微柱凝膠法判定為O型，常溫試管法發(fā)現(xiàn)正反定型不符。

1.2 血清學(xué)檢測

1.2.1 經(jīng)典試管法：嚴(yán)格按照《中國輸血技術(shù)操作規(guī)程》［3］進(jìn)行操作，結(jié)果見表1。

1.2.2 微柱凝膠法：EDTA抗凝血5 ml，3 000 r/min，5分鐘充分離心排除血漿內(nèi)纖維蛋白原干擾。嚴(yán)格按照戴安娜血型設(shè)備使用說明書及操作規(guī)程，進(jìn)行ABO正反定型、不規(guī)則抗體篩查、自身抗體檢測、直接抗體檢測。

ABO血型結(jié)果與試管法室溫立即離心結(jié)果不一致，正定型抗-A：-，抗B：-；反定型Ac：4+，Bc：2+，全自動系統(tǒng)判定為O型，見圖1。不規(guī)則抗體篩查：Ⅰ-、Ⅱ-、Ⅲ-。自身抗體陰性，直接抗體陰性。

表1 經(jīng)典試管法鑒定結(jié)果

圖1 微柱凝膠法鑒定ABO正反定型結(jié)果

1.2.3 吸收放散實驗：被檢紅細(xì)胞經(jīng)3次洗滌后留壓積紅細(xì)胞，加入抗-B血清4℃吸收1小時，中間每10分鐘震搖1次，離心取上清與標(biāo)準(zhǔn)抗-B血清對照，倍比稀釋加入B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，證實B抗原存在。吸收后壓積紅細(xì)胞多次洗滌后56℃熱放散10分鐘，離心取放散液加入B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞，檢測到B抗原存在，結(jié)果見表2。

1.3 分子生物學(xué)檢測

1.3.1 SSP基因分型：嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒操作說明書操作，DNA濃度 30～50 ng/μl，DNA純度A260/A280比率在1.6～2.0?；颊逜BO基因型為Bx01/O，結(jié)果見圖2。

表2 吸收放散試驗結(jié)果

圖2 ABO血型基因分型電泳圖

1.3.2 B基因第6、7外顯子測序（圖3）：對患者1 ～ 7外顯子基因測序結(jié)果為Bx01O1雜合子，根據(jù)NCBI提供的血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫，比對A101基因序列第6外顯子存在1個堿基突變：297 A＞G；第7外顯子存在7個堿基突變：526 C＞G；657 C＞T；703 G＞A；796 C＞A；803 G＞C； 871G＞A；930 G＞A。發(fā)生R 176 G、G 235 S、L 266 M、G 268 A、D 291 N氨基酸替換。

圖3 第6、7外顯子部分基因測序

2 討 論

ABO血型系統(tǒng)免疫原性最強(qiáng)，也是人類最早發(fā)現(xiàn)和認(rèn)定的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，對輸血安全、器官移植、法醫(yī)學(xué)鑒定、新生兒溶血病等意義重大，錯誤判斷血型會造成嚴(yán)重后果，甚至危及患者生命。除了常規(guī)的A、B、O、AB表型外，還存在著具有同一血型抗原，但抗原位點、結(jié)構(gòu)、性能等存在差異的ABO亞型系統(tǒng)。ABO亞型的血清學(xué)特點是與抗-A、抗-B反應(yīng)很弱，甚至無反應(yīng)，血清中易產(chǎn)生針對減弱抗原的血型抗體，給ABO血型鑒定帶來困難，易發(fā)生誤診。血清學(xué)ABO正反定型是目前臨床上檢測ABO血型的常規(guī)方法，實驗耗時少、簡單易操作，全自動微柱凝膠法應(yīng)用到血清學(xué)血型鑒定之后，避免了因?qū)嶒炇覘l件、操作者判斷凝集強(qiáng)度差異等帶來的誤差。有報道稱微柱凝膠法較經(jīng)典試管法靈敏，弱抗原抗體檢出率高［4-5］。但本實驗發(fā)現(xiàn)由于微柱凝膠法的分子篩只能通過游離單個紅細(xì)胞，能夠檢出部分肉眼不可見抗原抗體結(jié)合物造成假陽性結(jié)果，特別是反應(yīng)格局與正常ABO血型一致時會發(fā)生誤判。與報道因離心應(yīng)切力大于弱抗原抗體結(jié)合親和力造成假陰性結(jié)果不符，有待進(jìn)一步分析研究［6］。常溫經(jīng)典試管法由于對弱抗原抗體檢出率低于微柱凝膠法，更易發(fā)生正反定型不符的非常規(guī)反應(yīng)格局，更易于提示亞型存在的可能性；當(dāng)發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)格局或試管法與微柱凝膠法結(jié)果判斷不一致時，應(yīng)考慮亞型的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步完善血清學(xué)實驗，通過吸收放散、檢測血型物質(zhì)、抗體檢測等手段進(jìn)行確認(rèn)。目前《中華人民共和國藥典》未要求單克隆抗-B血清凝集B3、BX抗原紅細(xì)胞，ABO亞型漏檢發(fā)生率高，正定型加入抗-AB血清十分必要［7］。當(dāng)發(fā)生本文標(biāo)本正定型為O，反定型Ac、Bc一側(cè)已達(dá)4+且凝聚強(qiáng)度差接近2+時，將反定型標(biāo)本放入IgM抗體最適反應(yīng)條件的手段不可行。

雖然大部分ABO亞型血清學(xué)反應(yīng)格局已有總結(jié)，但比較籠統(tǒng)，同時由于大量單克隆血清代替多克隆血清在臨床上廣泛的使用，故以前由于單獨以血清學(xué)為基礎(chǔ)分類亞型的適當(dāng)性值得探討［8］。ABO血型系統(tǒng)由A、B、O 3個等位基因控制，A和B基因產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶（H轉(zhuǎn)移酶），在此基礎(chǔ)上A基因產(chǎn)生N-乙酰半乳糖轉(zhuǎn)移酶（A酶）、B基因產(chǎn)生半乳糖轉(zhuǎn)移酶（B酶），這兩種酶可使H寡糖鏈（H抗原）上加入特異性糖，而產(chǎn)生特異性A或B抗原，堿基突變造成氨基酸替換導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶活性喪失出現(xiàn)亞型。至今已發(fā)現(xiàn)ABO等位基因達(dá)300多個，大多數(shù)ABO亞型分子基礎(chǔ)已明確，隨著血型抗原基因數(shù)據(jù)庫的不斷完善，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行ABO亞型分類已經(jīng)逐步顯示出了特異性、準(zhǔn)確性的優(yōu)勢，成為了ABO疑難血型鑒定中血清學(xué)診斷的有力驗證。但是分子生物學(xué)同時存在試驗要求條件高、耗時長的缺點，不適用于目前日常臨床緊急狀況下使用。本文病例深度大面積燒傷、貧血、休克、急性腎衰竭急診入院，血清學(xué)發(fā)現(xiàn)疑難后緊急搶救給予AB型血漿2 000 ml，O型洗滌紅細(xì)胞4單位，經(jīng)血清學(xué)吸收放散發(fā)現(xiàn)B抗原存在，后續(xù)治療改為B型血漿輸注。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定患者血型為Bx01O01，由于患者存在不規(guī)則抗B抗體，仍采用配合型輸血O型洗滌紅細(xì)胞，患者無輸血反應(yīng)且無效輸血現(xiàn)象經(jīng)治療轉(zhuǎn)歸良好。

4 總 結(jié)

完善的血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)相結(jié)合能夠有效減少亞型漏檢，在滿足臨床緊急情況的前提下做到合理安全用血，是臨床輸血安全的最有效保障。Bx等位基因的個體血清中是否存在抗B報道不一［2，9］。本次發(fā)現(xiàn)的Bx01O01個例存在較強(qiáng)抗B抗體，或提示Bx血型表型存在較多異質(zhì)性，有待進(jìn)一步研究證實。