趙媛，劉偉，趙一賀，宋廣平，李代紅（天津市第一中心醫(yī)院輸血科，天津 300192）

ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)，除常見的ABO表型外，還有一類與正常ABO血型抗原結構、性能或抗原位點數有一定差異的亞型存在。亞型也有遺傳基礎，也具有明確的血清學特點［1］。例如：Bx亞型紅細胞與單克隆抗-B呈弱凝集，甚至不凝集；與抗-AB弱凝集～2+凝集；H抗原表達近似于O型紅細胞；血清中常伴有不規(guī)則抗B抗體，當抗體較強時極易誤診為O型；ABO亞型的誤診對臨床輸血安全、器官移植、骨髓移植、法醫(yī)學鑒定、新生兒溶血病造成嚴重危害。1990年首次通過基因測序明確了人類ABO血型系統(tǒng)中A1、B、O三個主要等位基因的分子生物學基礎，分子生物學逐步應用到人類血型鑒定。目前，被dbRBC NCBI血型抗原基因突變數據庫收集的Bx等位基因有12個，其分子機制均為點突變［2］。本文總結1例血清學極易誤診的Bx亞型伴有較強抗B抗體標本，結合分子生物學基因分型測序分析報道如下。

1 臨床資料

1.1 對象：先證者，男，39歲，漢族，大面積燒傷急診入院進行ABO血型鑒定時，微柱凝膠法判定為O型，常溫試管法發(fā)現(xiàn)正反定型不符。

1.2 血清學檢測

1.2.1 經典試管法：嚴格按照《中國輸血技術操作規(guī)程》［3］進行操作，結果見表1。

1.2.2 微柱凝膠法：EDTA抗凝血5 ml，3 000 r/min，5分鐘充分離心排除血漿內纖維蛋白原干擾。嚴格按照戴安娜血型設備使用說明書及操作規(guī)程，進行ABO正反定型、不規(guī)則抗體篩查、自身抗體檢測、直接抗體檢測。

ABO血型結果與試管法室溫立即離心結果不一致，正定型抗-A：-，抗B：-；反定型Ac：4+，Bc：2+，全自動系統(tǒng)判定為O型，見圖1。不規(guī)則抗體篩查：Ⅰ-、Ⅱ-、Ⅲ-。自身抗體陰性，直接抗體陰性。

表1 經典試管法鑒定結果

圖1 微柱凝膠法鑒定ABO正反定型結果

1.2.3 吸收放散實驗：被檢紅細胞經3次洗滌后留壓積紅細胞，加入抗-B血清4℃吸收1小時，中間每10分鐘震搖1次，離心取上清與標準抗-B血清對照，倍比稀釋加入B型標準紅細胞，證實B抗原存在。吸收后壓積紅細胞多次洗滌后56℃熱放散10分鐘，離心取放散液加入B型標準紅細胞，檢測到B抗原存在，結果見表2。

1.3 分子生物學檢測

1.3.1 SSP基因分型：嚴格按照DNA提取試劑盒操作說明書操作，DNA濃度 30～50 ng/μl，DNA純度A260/A280比率在1.6～2.0。患者ABO基因型為Bx01/O，結果見圖2。

表2 吸收放散試驗結果

圖2 ABO血型基因分型電泳圖

1.3.2 B基因第6、7外顯子測序（圖3）：對患者1 ～ 7外顯子基因測序結果為Bx01O1雜合子，根據NCBI提供的血型抗原基因突變數據庫，比對A101基因序列第6外顯子存在1個堿基突變：297 A＞G；第7外顯子存在7個堿基突變：526 C＞G；657 C＞T；703 G＞A；796 C＞A；803 G＞C； 871G＞A；930 G＞A。發(fā)生R 176 G、G 235 S、L 266 M、G 268 A、D 291 N氨基酸替換。

圖3 第6、7外顯子部分基因測序

2 討 論

ABO血型系統(tǒng)免疫原性最強，也是人類最早發(fā)現(xiàn)和認定的紅細胞血型系統(tǒng)，對輸血安全、器官移植、法醫(yī)學鑒定、新生兒溶血病等意義重大，錯誤判斷血型會造成嚴重后果，甚至危及患者生命。除了常規(guī)的A、B、O、AB表型外，還存在著具有同一血型抗原，但抗原位點、結構、性能等存在差異的ABO亞型系統(tǒng)。ABO亞型的血清學特點是與抗-A、抗-B反應很弱，甚至無反應，血清中易產生針對減弱抗原的血型抗體，給ABO血型鑒定帶來困難，易發(fā)生誤診。血清學ABO正反定型是目前臨床上檢測ABO血型的常規(guī)方法，實驗耗時少、簡單易操作，全自動微柱凝膠法應用到血清學血型鑒定之后，避免了因實驗室條件、操作者判斷凝集強度差異等帶來的誤差。有報道稱微柱凝膠法較經典試管法靈敏，弱抗原抗體檢出率高［4-5］。但本實驗發(fā)現(xiàn)由于微柱凝膠法的分子篩只能通過游離單個紅細胞，能夠檢出部分肉眼不可見抗原抗體結合物造成假陽性結果，特別是反應格局與正常ABO血型一致時會發(fā)生誤判。與報道因離心應切力大于弱抗原抗體結合親和力造成假陰性結果不符，有待進一步分析研究［6］。常溫經典試管法由于對弱抗原抗體檢出率低于微柱凝膠法，更易發(fā)生正反定型不符的非常規(guī)反應格局，更易于提示亞型存在的可能性；當發(fā)現(xiàn)異常反應格局或試管法與微柱凝膠法結果判斷不一致時，應考慮亞型的發(fā)現(xiàn)，進一步完善血清學實驗，通過吸收放散、檢測血型物質、抗體檢測等手段進行確認。目前《中華人民共和國藥典》未要求單克隆抗-B血清凝集B3、BX抗原紅細胞，ABO亞型漏檢發(fā)生率高，正定型加入抗-AB血清十分必要［7］。當發(fā)生本文標本正定型為O，反定型Ac、Bc一側已達4+且凝聚強度差接近2+時，將反定型標本放入IgM抗體最適反應條件的手段不可行。

雖然大部分ABO亞型血清學反應格局已有總結，但比較籠統(tǒng)，同時由于大量單克隆血清代替多克隆血清在臨床上廣泛的使用，故以前由于單獨以血清學為基礎分類亞型的適當性值得探討［8］。ABO血型系統(tǒng)由A、B、O 3個等位基因控制，A和B基因產生糖基轉移酶（H轉移酶），在此基礎上A基因產生N-乙酰半乳糖轉移酶（A酶）、B基因產生半乳糖轉移酶（B酶），這兩種酶可使H寡糖鏈（H抗原）上加入特異性糖，而產生特異性A或B抗原，堿基突變造成氨基酸替換導致糖基轉移酶活性喪失出現(xiàn)亞型。至今已發(fā)現(xiàn)ABO等位基因達300多個，大多數ABO亞型分子基礎已明確，隨著血型抗原基因數據庫的不斷完善，運用分子生物學技術進行ABO亞型分類已經逐步顯示出了特異性、準確性的優(yōu)勢，成為了ABO疑難血型鑒定中血清學診斷的有力驗證。但是分子生物學同時存在試驗要求條件高、耗時長的缺點，不適用于目前日常臨床緊急狀況下使用。本文病例深度大面積燒傷、貧血、休克、急性腎衰竭急診入院，血清學發(fā)現(xiàn)疑難后緊急搶救給予AB型血漿2 000 ml，O型洗滌紅細胞4單位，經血清學吸收放散發(fā)現(xiàn)B抗原存在，后續(xù)治療改為B型血漿輸注。經分子生物學鑒定患者血型為Bx01O01，由于患者存在不規(guī)則抗B抗體，仍采用配合型輸血O型洗滌紅細胞，患者無輸血反應且無效輸血現(xiàn)象經治療轉歸良好。

4 總 結

完善的血清學檢測和分子生物學相結合能夠有效減少亞型漏檢，在滿足臨床緊急情況的前提下做到合理安全用血，是臨床輸血安全的最有效保障。Bx等位基因的個體血清中是否存在抗B報道不一［2，9］。本次發(fā)現(xiàn)的Bx01O01個例存在較強抗B抗體，或提示Bx血型表型存在較多異質性，有待進一步研究證實。