李建華，張?chǎng)魏?，?岳，林方龍，陳新軍

（1．上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2．大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3．國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4．遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

中國(guó)槍烏賊（Uroteuthis chinensis）又稱本港魷魚(yú)、中國(guó)魷魚(yú)等［1］，隸屬頭足綱槍形目槍烏賊科槍烏賊屬，為暖水性大陸架海域物種［2］。在我國(guó)主要分布于南海大陸架、臺(tái)灣海峽中南部等海域［3］。中國(guó)槍烏賊在我國(guó)近海頭足類產(chǎn)量中占較大比重，是我國(guó)的主要捕撈對(duì)象［3－4］。年齡與生長(zhǎng)是研究頭足類生活史最基本的內(nèi)容之一，也是資源評(píng)估工作的基礎(chǔ)［5］。頭足類的耳石和角質(zhì)顎是重要的硬組織材料，都具有生長(zhǎng)紋結(jié)構(gòu)［6－8］，在頭足類的日齡、生長(zhǎng)及生活史等［9－10］研究中得到廣泛應(yīng)用。耳石輪紋清晰規(guī)律，是研究頭足類年齡和生長(zhǎng)最為廣泛和有效的硬組織材料，目前耳石制片方法、研究方法已經(jīng)非常成熟［11－12］。角質(zhì)顎輪紋位于角質(zhì)顎內(nèi)側(cè)，隨著越來(lái)越多的海洋生物工作者對(duì)其產(chǎn)生濃厚的興趣，角質(zhì)顎已逐漸成為除耳石外另一個(gè)研究頭足類年齡的重要硬組織，其優(yōu)點(diǎn)在于穩(wěn)定的形態(tài)特征、良好的信息儲(chǔ)存以及耐腐蝕等特點(diǎn)，學(xué)者對(duì)其應(yīng)用前景十分看好［13－14］。因此，本研究根據(jù)2016年在南海北部陸架區(qū)采集的中國(guó)槍烏賊樣本，分別利用耳石和角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)比較研究其年齡與生長(zhǎng)特點(diǎn)，對(duì)耳石和角質(zhì)顎的微結(jié)構(gòu)及輪紋數(shù)進(jìn)行差異性分析，并建立生長(zhǎng)模型，以期為今后槍烏賊年齡與生長(zhǎng)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 樣本采集

中國(guó)槍烏賊的樣品采集海域?yàn)槟虾１辈筷懠軈^(qū)（108°～118°E、20°～22°N），采集時(shí)間為2016年4月，樣品通過(guò)拖網(wǎng)捕獲，共隨機(jī)采取274尾樣本。

1．2 研究方法

1．2．1 生物學(xué)測(cè)定與耳石、角質(zhì)顎的提取

實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解凍后，對(duì)中國(guó)槍烏賊進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定，包括胴長(zhǎng)（mantel length，ML）、體質(zhì)量（body weight，BW）。測(cè)量胴長(zhǎng)用皮尺進(jìn)行，精確至1 mm，體質(zhì)量精確至1 g。用鑷子將左右兩個(gè)耳石分別從平衡囊中取出，清洗后存放于2 mL離心管中，并加入75%的乙醇存放。

角質(zhì)顎位于頭部口球中，口器為幾丁質(zhì)，下顎包含著上顎，所以提取角質(zhì)顎時(shí)應(yīng)先取出下顎再取出上顎，角質(zhì)顎取出后應(yīng)用清水進(jìn)行漂洗，去除附著于表面的有機(jī)物質(zhì)，存放于50 mL離心管中，并加入75%的乙醇。

1．2．2 耳石、上角質(zhì)顎切片制作

中國(guó)槍烏賊耳石背區(qū)的生長(zhǎng)紋更加清晰［15］，故本研究選擇背區(qū)面進(jìn)行研磨。根據(jù)LIU等［16］對(duì)莖柔魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)紋位于喙部的矢狀切面上，因此本研究取喙部進(jìn)行研磨。由于中國(guó)槍烏賊個(gè)體小且角質(zhì)顎較小，增大了角質(zhì)顎的研磨難度。故本次研究實(shí)驗(yàn)只成功研磨出33尾中國(guó)槍烏賊樣品的上角質(zhì)顎，耳石研磨成功樣品為173尾。

本次研究實(shí)驗(yàn)均使用Struers LaboPol－6研磨機(jī)。

1．2．3 輪紋計(jì)數(shù)

研磨好的耳石和角質(zhì)顎切片放置在Olympus雙筒光學(xué)顯微鏡（型號(hào)為CX21FS1）下，使用40倍物鏡用DP71進(jìn)行拍照；由于耳石以及角質(zhì)顎的拍照在顯微鏡下無(wú)法一次完成，故采用多次拍照再使用Adobe Photoshop CS6對(duì)圖片進(jìn)行疊加拼合，最終得到完整的耳石與角質(zhì)顎圖片。每張樣品圖片上的生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)由兩位觀察者分別進(jìn)行，若計(jì)數(shù)的均值差異程度不高于10%，則視為該數(shù)據(jù)有效［17］。

1．2．4 數(shù)據(jù)的處理

1）處理耳石和角質(zhì)顎的生物學(xué)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)其胴長(zhǎng)的頻度分布，再建立胴長(zhǎng)和體質(zhì)量的4種函數(shù)關(guān)系：線性、指數(shù)、冪函數(shù)和對(duì)數(shù)函數(shù)，利用最小AIC法選擇最適的生長(zhǎng)模型。

2）對(duì)胴長(zhǎng)體重生長(zhǎng)模型、耳石生長(zhǎng)紋的生長(zhǎng)模型以及角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的生長(zhǎng)模型進(jìn)行差異分析。

本研究均利用SPSS 23．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 胴長(zhǎng)與體重組成及其關(guān)系

如表1所示，本研究采集的中國(guó)槍烏賊樣本胴長(zhǎng)范圍為66～476 mm，體質(zhì)量范圍14～767 g，胴長(zhǎng)平均值為159 mm，體質(zhì)量平均值為191 g。耳石日齡的范圍為89～324 d，平均值為144 d。角質(zhì)顎日齡的范圍為70～197 d，平均值為127 d。

如圖1所示，本次采集的中國(guó)槍烏賊樣本胴長(zhǎng)小于100 mm的占樣品總數(shù)9%、100～200 mm占54%，200～300 mm占31%，大于300 mm占6%。其胴長(zhǎng)組成符合正態(tài)分布。其中優(yōu)勢(shì)胴長(zhǎng)組為100～200 mm。

胴長(zhǎng)（ML）與體質(zhì)量（BW）呈明顯的冪函數(shù)生長(zhǎng)關(guān)系，生長(zhǎng)方程為：BW＝0．001 1ML2．2261（R2＝0．925 1）（圖2）。

2．2 耳石微結(jié)構(gòu)

觀察發(fā)現(xiàn)，中國(guó)槍烏賊耳石的輪紋存在于吻區(qū)、翼區(qū)、背區(qū)和側(cè)區(qū)，其中以背區(qū)的生長(zhǎng)紋最為清晰。背區(qū)的微結(jié)構(gòu)在顯微鏡下觀察可區(qū)分中心核心、核心區(qū)、后核心區(qū)、暗區(qū)以及外圍區(qū)這5個(gè)區(qū)域，且生長(zhǎng)紋由明暗相間的環(huán)紋組成（圖3）。核心區(qū)存在初始紋，初始紋較難觀察。核心區(qū)以外的區(qū)域可根據(jù)生長(zhǎng)紋的間隔寬度來(lái)區(qū)分出后核心區(qū)、暗區(qū)、外圍區(qū)。后核心區(qū)的生長(zhǎng)紋間隔較大，暗區(qū)的生長(zhǎng)紋間隔最大，外圍區(qū)的生長(zhǎng)紋間隔最小。外圍區(qū)是最難研磨和觀察到生長(zhǎng)紋的區(qū)域。

表1 中國(guó)槍烏賊胴長(zhǎng)和體質(zhì)量范圍Tab．1 M antle length and weight range of U．chinensis

圖1 中國(guó)槍烏賊胴長(zhǎng)頻率分布圖Fig．1 Distribution ofmantle length frequency for U．chinensis

圖2 中國(guó)槍烏賊胴長(zhǎng)和體質(zhì)量關(guān)系Fig．2 Relationship between mantle length and body weight for U．chinensis

圖3 中國(guó)槍烏賊耳石背區(qū)微結(jié)構(gòu)Fig．3 Dorsal dome statolith m icrostructure of U．chinensis

對(duì)中國(guó)槍烏賊耳石背區(qū)生長(zhǎng)紋進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，亞日輪在暗區(qū)較常見(jiàn) （圖4－a），與日輪近乎重合，但亞日輪不如日輪明顯。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)有6種不同的標(biāo)記輪的存在，在核心區(qū)末端存在明顯不同于其他生長(zhǎng)紋的第1類標(biāo)記輪（圖4－b），出現(xiàn)在后核心區(qū)的第2類標(biāo)記輪（圖4－b），以及出現(xiàn)在后核心區(qū)和暗區(qū)過(guò)渡帶的第3類標(biāo)記輪（圖4－b），第4類標(biāo)記輪（圖4－c）則出現(xiàn)在暗區(qū)和外圍區(qū)之間，第5類標(biāo)記輪在外圍區(qū)（圖4－c），第6類標(biāo)記輪則出現(xiàn)在半月帶或月帶（圖4－d）。

2．3 上角質(zhì)顎的微結(jié)構(gòu)

角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋存在于其內(nèi)部，對(duì)中國(guó)槍烏賊的上角質(zhì)顎進(jìn)行縱面切割研磨，觀察其在顯微鏡下的整體圖（圖5－a），發(fā)現(xiàn)角質(zhì)顎喙部的頭蓋區(qū)生長(zhǎng)紋和側(cè)壁區(qū)生長(zhǎng)紋以對(duì)稱的形式排列在分叉到喙部分界線的兩端。且其生長(zhǎng)紋與耳石生長(zhǎng)紋相似，以明暗相間的排列方式分布于角質(zhì)顎喙部。并且明顯觀察到，頭蓋區(qū)的色素沉積相比于側(cè)壁區(qū)要深很多。同樣，角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋中也存在有亞日輪（圖5－b）以及標(biāo)記輪（圖5－c），角質(zhì)顎標(biāo)記輪種類較耳石少。值得注意的是，角質(zhì)顎標(biāo)記輪附近的生長(zhǎng)紋比其它生長(zhǎng)紋更加明顯，即暗帶比其它暗帶更暗，反之亮帶更亮。觀察整體的生長(zhǎng)紋，發(fā)現(xiàn)從分叉到喙部，生長(zhǎng)紋的間隔越來(lái)越小，生長(zhǎng)紋越來(lái)越細(xì)。在角質(zhì)顎喙部發(fā)現(xiàn)有異常結(jié)構(gòu)，一般出現(xiàn)在喙部邊緣（圖5－d）。

2．4 年齡組成

耳石切片日齡范圍為89～324 d，均值為144 d，耳石優(yōu)勢(shì)日齡組為 120～150 d，占總數(shù)的31．2%；其次是150～180 d和90～120 d，分別占總數(shù)的30．6%和26%，耳石日齡組成頻度符合正態(tài)分布（圖6）。角質(zhì)顎切片日齡范圍為70～197 d，均值為127 d。角質(zhì)顎優(yōu)勢(shì)日齡組為90～120 d，占總數(shù)的39．4%；其次是120～150 d，占總數(shù)的24．2%，角質(zhì)顎日齡組成頻度也符合正態(tài)分布（圖7）。

如表2所示，角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋數(shù)目明顯小于耳石的生長(zhǎng)紋數(shù)目，耳石生長(zhǎng)紋數(shù)目小于200 d，角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋數(shù)目與耳石生長(zhǎng)紋數(shù)目較接近，但耳石生長(zhǎng)紋數(shù)目大于200 d時(shí)，角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋數(shù)目約等于耳石生長(zhǎng)紋數(shù)目的一半。

2．5 耳石輪紋和角質(zhì)顎輪紋與胴長(zhǎng)的關(guān)系

對(duì)耳石和角質(zhì)顎日齡的分析結(jié)果表明，耳石輪紋和胴長(zhǎng)較為符合線性相關(guān)關(guān)系：N＝0．374 4ML＋71．326（R2＝0．850 4，P＜0．01）（圖8）；

角質(zhì)顎和胴長(zhǎng)符合線性相關(guān)關(guān)系：

M＝0．266 4ML＋62．505（R2＝0．845 2，P＜0．01）（圖 9）。

式中：N為耳石輪紋數(shù)，M為角質(zhì)顎輪紋數(shù)，ML為胴長(zhǎng)。

圖4 中國(guó)槍烏賊耳石微結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)紋Fig．4 Statolith m icrostructure of U．chinensis

圖5 中國(guó)槍烏賊上角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)Fig．5 Upper beak m icrostructure of U．chinensis

圖6 耳石年齡組成頻度分布圖Fig．6 Age frequency distribution of statolith

圖7 角質(zhì)顎年齡組成頻度分布圖Fig．7 Age frequency distribution of beak

圖8 耳石輪紋與胴長(zhǎng)關(guān)系Fig．8 Relationship between statolith increments and mantle length

表2 耳石和角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋對(duì)照表Tab．2 Increment differences table for statolith and beak

圖9 角質(zhì)顎輪紋與胴長(zhǎng)關(guān)系Fig．9 Relationship between beak increments and mantle length

3 討論

3．1 耳石微結(jié)構(gòu)

中國(guó)槍烏賊耳石微結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)紋排列方式和其它頭足類耳石生長(zhǎng)紋相似［18－19］，都是由明暗相間的環(huán)紋組成，且核心區(qū)內(nèi)的初始輪紋不明顯，觀察計(jì)數(shù)有難度。研究發(fā)現(xiàn)暗區(qū)的條紋間隔寬度最寬，后核區(qū)次之，外圍區(qū)間隔最窄，并且胴長(zhǎng)個(gè)體越大越為明顯，以此可以推斷耳石微結(jié)構(gòu)的各個(gè)區(qū)域的形成與中國(guó)槍烏賊的發(fā)育有關(guān)，這一結(jié)果與ARKHIPKIN［10］的結(jié)論相似。

在中國(guó)槍烏賊耳石中發(fā)現(xiàn)6類標(biāo)記輪，這與前人對(duì)其它頭足類耳石微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相似［20］，其中1～4類標(biāo)記輪在各個(gè)區(qū)域的過(guò)渡帶或者邊緣，本研究認(rèn)為標(biāo)記輪代表著中國(guó)槍烏賊的生長(zhǎng)變化規(guī)律。

3．2 上角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)

中國(guó)槍烏賊上角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋與其它頭足類相似［21］，都對(duì)稱地分布在喙部截面縱軸的兩側(cè)，靠近分叉口附近生長(zhǎng)紋間距寬，而靠近喙部生長(zhǎng)紋間距窄。與喙部截面相比，側(cè)壁區(qū)色素沉著淺，生長(zhǎng)紋容易觀察到，然而側(cè)壁區(qū)的生長(zhǎng)紋交錯(cuò)重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，且側(cè)壁區(qū)邊緣常出現(xiàn)生長(zhǎng)紋缺失，使得輪紋計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，無(wú)法顯示完整的生長(zhǎng)紋。角質(zhì)顎喙部生長(zhǎng)紋的沉積是由分叉口開(kāi)始向喙部沉積，靠近分叉口生長(zhǎng)紋代表生長(zhǎng)早期，生長(zhǎng)速率快，靠近喙部生長(zhǎng)紋代表成體期，生長(zhǎng)速率慢，生長(zhǎng)紋的變化趨勢(shì)與中國(guó)槍烏賊的生長(zhǎng)速率變化趨勢(shì)一致。從圖6－b可觀察分析，角質(zhì)顎喙部存在大量的色素沉積，色素過(guò)深的區(qū)域生長(zhǎng)紋難以觀察到，但是如果沒(méi)有色素沉著，無(wú)法對(duì)生長(zhǎng)紋進(jìn)行觀察，反而是透紅的區(qū)域生長(zhǎng)紋最為清晰。因此在研磨時(shí)要盡量將角質(zhì)顎兩面磨薄至色素透紅，這樣生長(zhǎng)紋的觀察會(huì)最清晰且計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。

在上角質(zhì)顎的輪紋計(jì)數(shù)中發(fā)現(xiàn)與耳石微結(jié)構(gòu)中相似的標(biāo)記輪，角質(zhì)顎標(biāo)記輪的存在使得其附近的生長(zhǎng)紋更為突出，而標(biāo)記輪的生成與溫度突變、風(fēng)暴、被捕時(shí)逃脫等外界的環(huán)境影響有關(guān)［10］。本研究在觀察角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)5尾中國(guó)槍烏賊的角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋存在不平整的現(xiàn)象，有些區(qū)域的生長(zhǎng)紋會(huì)突然出現(xiàn)彎曲不平整，隨后又正常平整的排列，這可能是由于角質(zhì)顎受到外界環(huán)境改變的刺激，從而使其沉淀作用混亂，待到沉淀作用正常后生長(zhǎng)紋又開(kāi)始規(guī)則的排列。角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)垂直交叉于生長(zhǎng)紋的細(xì)微條紋，這是由于角質(zhì)顎的沉積作用會(huì)在不同的方向上進(jìn)行［19］。角質(zhì)顎喙部存在一些異常結(jié)構(gòu)，由于角質(zhì)顎存在于頭足類口腔中，在捕食過(guò)程中其喙部易被腐蝕，導(dǎo)致腐蝕的位置無(wú)法進(jìn)行生長(zhǎng)紋的計(jì)數(shù)。因此可以通過(guò)觀察其他區(qū)域的生長(zhǎng)紋來(lái)減少喙部異常結(jié)構(gòu)的影響。LIU等［16］的研究也表明，當(dāng)出現(xiàn)影響生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)的角質(zhì)顎異常結(jié)構(gòu)部位時(shí)，可以通過(guò)觀察角質(zhì)顎頭蓋背側(cè)邊緣的生長(zhǎng)紋，從而減少誤差。

3．3 耳石微結(jié)構(gòu)和角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)比較

中國(guó)槍烏賊耳石和角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)有一定的相似性，兩者都有生長(zhǎng)紋的沉積，且在一定程度上可以反映個(gè)體年齡生長(zhǎng)規(guī)律。標(biāo)記輪的存在可能與其生存環(huán)境有關(guān)［17］。從生長(zhǎng)紋的變化波動(dòng)可以推測(cè)個(gè)體生存環(huán)境的大致變化，耳石和角質(zhì)顎都有標(biāo)記輪的存在，耳石標(biāo)記輪種類較多，而角質(zhì)顎標(biāo)記輪種類較少，故從耳石生長(zhǎng)紋上可以獲得更多的生長(zhǎng)信息。耳石和角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)同樣存在日輪和亞日輪，日輪與亞日輪的存在是對(duì)其進(jìn)行生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)時(shí)產(chǎn)生誤差的一個(gè)主要因素，所以需要仔細(xì)分辨亞日輪來(lái)減少判讀誤差。生長(zhǎng)紋的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度影響了其日齡的估算，對(duì)比本次耳石輪紋數(shù)和角質(zhì)顎輪紋數(shù)發(fā)現(xiàn)，耳石輪紋數(shù)普遍比角質(zhì)顎輪紋數(shù)高，這是由于角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)上生長(zhǎng)紋會(huì)出現(xiàn)疊加沉積導(dǎo)致其輪紋數(shù)不全面，而且物種越小生長(zhǎng)紋疊加現(xiàn)象越嚴(yán)重，同時(shí)喙部往往因?yàn)閭€(gè)體捕食等行為造成邊緣磨損，進(jìn)而造成輪紋缺失，導(dǎo)致以角質(zhì)顎輪紋得到的日齡小于實(shí)際日齡。中國(guó)槍烏賊個(gè)體小于其它大多數(shù)頭足類，其角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋較其他頭足類難以觀察。

3．4 胴長(zhǎng)與體質(zhì)量、耳石輪紋和角質(zhì)顎輪紋關(guān)系

研究表明，中國(guó)槍烏賊的胴長(zhǎng)與體質(zhì)量關(guān)系符合冪函數(shù)生長(zhǎng)模型，由胴長(zhǎng)頻率分布圖（圖1）及冪函數(shù)相關(guān)圖（圖2）可以發(fā)現(xiàn)，胴長(zhǎng)為100～200 mm的個(gè)體占大多數(shù)；胴長(zhǎng)為200 mm以下的中國(guó)槍烏賊樣品平均體質(zhì)量增加較慢，而胴長(zhǎng)200 mm以上的則增長(zhǎng)迅速。由此推斷中國(guó)槍烏賊在胴長(zhǎng)200 mm左右為快速成長(zhǎng)期，隨著性腺的不斷成熟生長(zhǎng)速度也變慢，符合大多數(shù)頭足類的生長(zhǎng)規(guī)律［10］。

胴長(zhǎng)在300 mm以下個(gè)體的生長(zhǎng)紋數(shù)較有規(guī)律，基本在參考線兩側(cè)；但是300 mm以上的個(gè)體則波動(dòng)較大（圖8，圖9）。這與胴長(zhǎng)仍受到體質(zhì)量、發(fā)育以及捕食等很多因素的影響有關(guān)［22－23］。

綜上所述，對(duì)于中國(guó)槍烏賊樣品的年齡鑒定，建議選擇耳石微結(jié)構(gòu)來(lái)估算其日齡。在研究頭足類年齡和生長(zhǎng)的時(shí)候不能局限于只用一種方法，選擇多種研究方法，對(duì)比分析各方法優(yōu)劣，根據(jù)多種方法的結(jié)果討論其原因，與使用單一的耳石微結(jié)構(gòu)或角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)方法研究相比，兩種研究方法的對(duì)比分析，可以更好的根據(jù)該物種的特性來(lái)對(duì)比研究得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果，從而選擇更適合地材料和方法。因此，在今后的研究中，應(yīng)不斷改進(jìn)頭足類的年齡生長(zhǎng)研究方法，使用耳石和角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，使其研究結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。