茹文紅，鄭曉婷，段亞飛，董宏標(biāo)，劉青松，張家松

（1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

鹵蟲（Artemia），又稱鹽水豐年蟲，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda），有鰓亞門（Branchiata），甲殼綱（Crustacea），鰓足亞綱（Branchiopoda），鹽水豐年蟲科（Branchinectidae）。鹵蟲分布范圍極其廣泛，在世界許多碳酸鹽和硫酸鹽的自然湖泊和人工鹽池中均有分布［1］。鹵蟲的發(fā)育一般經(jīng)歷5個(gè)階段：卵（egg）、無(wú)節(jié)幼蟲期（nauplius stage）、后無(wú)節(jié)幼蟲期（metanauplius stage）、擬成蟲期（pseudo adult stage）和成蟲期（adult stage）。無(wú)節(jié)幼蟲期是指蛻皮0～1次的幼蟲，其身體不分節(jié)且經(jīng)歷一次蛻皮后消化道明顯可見(jiàn)，呈筒狀；后無(wú)節(jié)幼蟲期是指蛻皮2～5次的幼蟲，其胸部開始分節(jié)，消化道開始具備生理功能；擬成蟲期是指蛻皮6～10次的幼蟲，其外形與成體相似［2］。

鹵蟲具有營(yíng)養(yǎng)豐富、個(gè)體小、生長(zhǎng)周期短、繁殖速度快和易于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于水產(chǎn)餌料［3］、生物載體［4］、發(fā)育生物學(xué)［5－6］、免疫學(xué)［7－9］和毒理學(xué)［10－11］等領(lǐng)域研究。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鹵蟲的研究主要集中在鹵蟲基礎(chǔ)生物學(xué)方面，如分類、卵特性、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖習(xí)性以及在水產(chǎn)餌料中的應(yīng)用等，而有關(guān)鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較少。

動(dòng)物腸道是消化吸收的主要場(chǎng)所，其中棲息著數(shù)量龐大的微生物，形成了一個(gè)復(fù)雜和相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生物能夠影響動(dòng)物生長(zhǎng)、消化吸收及健康［12］。研究表明，凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）腸道內(nèi)分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能分泌多種胞外消化酶［13］；鮸魚（Miichthysmiiuy）腸道內(nèi)分離出的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）對(duì)有機(jī)質(zhì)有較強(qiáng)分解能力［14］；草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道內(nèi)檢測(cè)到的擬桿菌屬（Bacteroides）能夠?yàn)槟c黏膜提供能量，可以促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)和生長(zhǎng)［15］。因此，本研究以室內(nèi)養(yǎng)殖的巴里坤鹵蟲（Artemia parthenogenetica）為研究對(duì)象，采用Illumina MiSep高通量測(cè)序技術(shù)研究無(wú)節(jié)幼蟲期、后無(wú)節(jié)幼蟲期、擬成蟲期和成蟲期4個(gè)時(shí)期腸道菌群結(jié)構(gòu)，旨在為初步探究腸道菌群對(duì)鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期個(gè)體生長(zhǎng)、蛻皮、免疫等影響提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 供試材料

鹵蟲的休眠卵采自于西藏巴里坤湖（購(gòu)于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司）。螺旋藻為科晶牌螺旋藻粉（購(gòu)于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司），用之前高溫滅菌半小時(shí)［16］，再以滅過(guò)菌的人工海水制成懸濁液，現(xiàn)配現(xiàn)用。養(yǎng)殖期間所用的人工海水為海水晶（廣州市海神水族科技服務(wù)公司）與蒸餾水以3∶100比例混合配制，經(jīng)100目篩絹網(wǎng)過(guò)濾后，高壓滅菌的人工海水（鹽度30，pH值8．3）。

1．2 鹵蟲的孵化與培養(yǎng)

鹵蟲卵的消毒參照BARUAH［17］的方法并稍加修改進(jìn)行。取鹵蟲卵400 mg，用蒸餾水浸泡并曝氣1 h。加入32%氫氧化鈉660μL和50%次氯酸鈉50 mL進(jìn)行消毒100 s，然后加入10 g·L－1硫代硫酸鈉14 mL，孵育2 min。最后用人工海水洗滌至無(wú)色。將消毒脫殼的鹵蟲卵放入盛有60 mL人工海水的培養(yǎng)瓶中孵化24 h。孵化期間溫度30℃，鹽度30，pH 8．3，光照強(qiáng)度2 000 lx，使用0．22μm空氣過(guò)濾器過(guò)濾曝氣。整個(gè)孵化過(guò)程置于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，孵化設(shè)置3個(gè)平行組。

將每個(gè)平行組孵化出來(lái)的鹵蟲無(wú)節(jié)幼蟲分別放于盛有800 mL人工海水的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行養(yǎng)殖，密度為4尾·mL－1（養(yǎng)殖與孵化條件一致）。每2 d換水一次，每次換水1／2。每天投喂餌料一次，投喂量為 8 mg·L－1［18－19］。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程置于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1．3 樣品采集與處理

1．3．1 樣品的采集

分別在無(wú)節(jié)幼蟲期（S1，24 h）、后無(wú)節(jié)幼蟲期（S2，48 h）、擬成蟲期（S3，144 h）、成蟲期（S4，264 h）采集鹵蟲個(gè)體300、300、200、100尾。采集的樣品經(jīng)過(guò)處理后可用于腸道菌群測(cè)定，參照VERNER-JEFFREYS［20］和 NIU［21］的方法并稍加改進(jìn)，具體操作為：無(wú)菌的條件下，利用鹵蟲的趨光性，用滅菌的吸管吸取鹵蟲個(gè)體，置于150目的網(wǎng)篩中，用滅菌海水沖洗3次；然后，在無(wú)菌的2 mL EP管中均質(zhì)化，用于提取鹵蟲腸道菌群DNA。

1．3．2 DNA提取和16S rDNA宏基因組測(cè)序

利用EZNA?Stool DNA Kit試劑盒提取鹵蟲腸道菌群DNA。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到清晰的 DNA條帶。用 Thermo Scientific微量核酸檢測(cè)儀NC2000檢測(cè)DNA的質(zhì)量，得到 OD260／280＝1．99～2．00，符合 Illumina Misep測(cè)序要求。使用帶有測(cè)序條形碼標(biāo)簽的引物 515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和 806R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）對(duì)細(xì)菌的 16S rDNA的V4-V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

利用Q5?High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，包括5×Reaction Buffer 4μL，5×GC Buffer 5μL，2．5 mM dNTP 2μL，10μM（正反引物各 1μL），DNA Template 2μL，ddH2O 8．75μL，Q5High-Fidelity DNA Polymerase 0．25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，2 min；（98℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s）×30個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，定量?jī)x器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx 800）。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照各樣本的測(cè)序量需求進(jìn)行相應(yīng)比例混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)。制備好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Agilent Bioanalyzer質(zhì)檢和Promega QuantiFluor熒光定量，確定文庫(kù)合格后，用Illumina MiSeq測(cè)序（北京微生太科技有限公司）。

1．4 測(cè)序結(jié)果處理與分析

1）將Illumina MiSeq高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)堿基平均測(cè)序準(zhǔn)確率進(jìn)行初步篩查，利用 FLASH（V1．2．7，http：／／ccb．jhu．edu／software／FLASH／）對(duì)每個(gè)樣品Reads進(jìn)行配對(duì)連接，去除嵌合體等疑問(wèn)序列；2）使用QIIME軟件（Version 1．7．0），調(diào)用 UCLUST序列比對(duì)工具對(duì)獲得序列按97%序列相似度進(jìn)行OTU歸并和劃分，將豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0．001%（十萬(wàn)分之一）OTU去除，選取每個(gè)OTU中豐度最高序列作為該OTU代表序列，然后將每個(gè)OTU代表序列與 Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù) （Release 13．8，http：／／greengenes．secondgenome．com／）進(jìn)行比對(duì)，得到OTU各分類等級(jí)水平的注釋比例和物種相對(duì)豐度，為避免由于測(cè)序深度不同造成偏差，對(duì)各樣品數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)量最少樣品為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，根據(jù)各樣本 OTU數(shù)，使用 R軟件（Version 2．15．3）繪制 Venn圖；3）根據(jù) OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，使用 R軟件（Version 2．15．3）繪制各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，使用QIIME軟件（Version 1．7．0），獲取各樣本在門、綱、目、科、屬五個(gè)分類水平上的組成和豐度分布表，使用SIGMAPLOT 12．5繪制特定樣本在特定分類水平組成的柱狀圖；4）使用 QIIME軟件（Version 1．7．0）分別計(jì)算每個(gè)樣本 Simpson多樣性指數(shù)、Chao1豐富度估計(jì)指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、ACE豐富度估計(jì)指數(shù)及兩種Beta多樣性距離（Weighted Unifrac和 Unweighted Unifrac），使用R軟件（Version 2．15．3）繪制 Rarefaction稀釋曲線和PCoA圖；5）所得數(shù)據(jù)使用SPSS 17．0軟件中Duncan多重比較法進(jìn)行單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，P＜0．05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 Illum ina M iSeq測(cè)序結(jié)果

12個(gè)腸道細(xì)菌樣品采用Illumina MiSeq測(cè)序并優(yōu)化質(zhì)控后共得到672 826條有效序列，每個(gè)樣品平均56 068條，長(zhǎng)度主要為392～394 bp，平均為393 bp。鹵蟲4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組分別獲得339～647個(gè)不同的OTU?；?7%相似性水平劃分OTUs的稀釋曲線結(jié)果顯示，各個(gè)樣品的序列均達(dá)到40 000條以上時(shí)，曲線趨于平緩，表明樣品的序列測(cè)序數(shù)量可以有效覆蓋文庫(kù)（圖1）。

圖1 腸道菌群?jiǎn)蝹€(gè)樣品中OTUs稀釋曲線Fig．1 Rarefaction curves for OTUs in each sam ple

2．2 腸道菌群多樣性

利用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指標(biāo)評(píng)估鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期腸道菌群的α多樣性。結(jié)果顯示，與S1組相比，S2、S3和S4組的α多樣性指數(shù)均顯著升高（P＜0．05），但3組之間不存在顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

基于4組鹵蟲腸道菌群全部有效OTU數(shù)繪制的Venn圖（圖2）顯示，有效OTU共2105個(gè)，4組共有OTU169個(gè)。其中，S3組特有OTU最多，為83個(gè)；其次為S4組、S1組和S2組，分別為82、35和30個(gè)。基于weighted和unweighted UniFrac距離的PCoA分析顯示，4組鹵蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異（圖3）。

2．3 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成變化

在門分類水平上變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在4組鹵蟲腸道菌群的相對(duì)豐度均達(dá)到94%以上，為優(yōu)勢(shì)菌群。其中，4組間變形菌門的相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異（P＞0．05）；S1、S2和S3組間厚壁菌門的相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異（P＞0．05），與 S3組相比，S4組厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著減少（P＜0．05）。此外，4組擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0．05）（圖4）。

表1 巴里坤鹵蟲腸道菌群α多樣性指數(shù)Tab．1 α-diversity of intestinem icrobiota in Artem ia parthenogenetica

圖2 巴里坤鹵蟲腸道共有OTU分析圖Fig．2 Shared OTU analysis of intestinem icrobiota in Artem ia parthenogenetica

在綱分類水平上共有8個(gè)菌綱的相對(duì)豐度≥ 0． 50% （圖 5）。 γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、 α-變 形 菌 綱（Alphaproteobacteria）及芽孢桿菌綱（Bacilli）為優(yōu)勢(shì)菌群。α-變形菌綱在S1組中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為51．1%；與S1組對(duì)比，其相對(duì)豐度在S2、S3和S4組中顯著減少（P＜0．05）。與 S1組相比，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）在 S2、S3和S4組中的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0．05）。

在屬分類水平上共有19個(gè)菌屬的相對(duì)豐度≥0．10% （圖 6）。結(jié) 果 顯 示，副 球 菌 屬（Paracoccus）在S1組中的相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其在S2、S3和 S4組中顯著減少（P＜0．05）。假單胞桿菌屬（Pseudomonas）和交替赤桿菌屬（Altererythrobacter）的相對(duì)豐度在4組中逐漸增加，而微小桿菌屬（Exiguobacterium）的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢(shì)。鹽單胞桿菌屬（Halomonas）的相對(duì)豐度在S1和S2組中無(wú)變化（P＞0．05），而在 S3組中顯著減少（P＜0．05）。嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的相對(duì)豐度在S2和S3組中顯著增加（P＜0．05），而在S4組中顯著減少（P＜0．05）。短波單胞菌屬（Brevundimonas）的相對(duì)豐度在4組間存在顯著差異（P＜0．05）。對(duì)于稀有菌屬（Limnobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、小紅卵菌屬（Rhodovulum）和普氏菌屬 9（Prevotella9）的相對(duì)豐度在4組中逐漸增加，而赤桿菌屬（Erythrobacter）和鞘脂菌屬（Sphingobium）的相對(duì)豐度在4組中逐漸減少。

圖3 巴里坤鹵蟲腸道菌群PCoA分析Fig．3 Principal coordinates analysis（PCoA）of the intestinem icrobial communities in different samp les

圖4 腸道菌群門水平相對(duì)豐度Fig．4 Relative abundance of intestinem icrobiota at the phylum level

圖5 腸道菌群綱水平相對(duì)豐度Fig．5 Relative abundance of intestinem icrobiota at the class level

圖6 腸道菌群屬水平相對(duì)豐度Fig．6 Relative abundance of intestinem icrobiota at the genus level

3 討論

本研究利用Illumina MiSep高通量測(cè)序技術(shù)，在不同分類水平上對(duì)巴里坤鹵蟲不同發(fā)育階段的腸道菌群組成及變化規(guī)律進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，鹵蟲在不同發(fā)育時(shí)期的腸道菌群組成不斷發(fā)生變化。從α多樣性指數(shù)和PCoA圖可以看出，隨著鹵蟲的正常發(fā)育，其各生長(zhǎng)時(shí)期的腸道菌群多樣性增加，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜化，與多佛比目魚（Solea solea）［22］研究結(jié)果一致。CAMPBELL等［22］研究了多佛比目魚不同發(fā)育時(shí)期的腸道菌群變化，結(jié)果表明，其成魚期腸道菌群組成比仔魚期豐富。相關(guān)研究表明，動(dòng)物自身的生長(zhǎng)時(shí)期及健康狀況能夠影響其腸道菌群組成［23］，其可能是造成鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期腸道菌群存在差異的主要原因。

隨著鹵蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，擬桿菌門和放線菌門細(xì)菌逐漸增加。研究表明，擬桿菌門細(xì)菌能夠吸收和降解有機(jī)物質(zhì)，降解多種生物聚合物如纖維素和幾丁質(zhì)［24－25］。此外，擬桿菌門細(xì)菌還能利用腸道內(nèi)植物來(lái)源的底物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為宿主腸道提供能量，促進(jìn)不可消化組分的能量攝入最大化［26］。因此，本研究中擬桿菌門細(xì)菌的增加可能與其促進(jìn)鹵蟲消化植物性食物有關(guān)。放線菌門細(xì)菌能夠產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中許多是有效的抗生素，能夠提高動(dòng)物的抗病能力［27］。在綱分類水平上，α-變形菌綱細(xì)菌為無(wú)節(jié)幼蟲期鹵蟲腸道優(yōu)勢(shì)菌群，其后γ-變形菌綱細(xì)菌的相對(duì)豐度升高，變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群，表明鹵蟲的生長(zhǎng)發(fā)育期間，其腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了更替。究其原因，在屬分類水平上α-變形菌綱中的副球菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度顯著減少（P＜0．05），而γ-變形菌綱中的假單胞桿菌相對(duì)豐度顯著增加（P＜0．05）。

在屬分類水平上，假單胞菌屬細(xì)菌隨鹵蟲的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程其相對(duì)豐度從0．7%顯著增加到24．3%（P＜0．05）。研究表明，假單胞菌屬為水產(chǎn)動(dòng)物腸道中常見(jiàn)的菌屬［28］，其中部分細(xì)菌能夠有效抑制致病菌。例如，熒光假單胞菌AH2能夠抑制鰻弧菌（Vibrio anguillarum）以降低虹鱒（Oncorynchus mykiss）的 死亡 率［29］；假 單 胞 菌MCCB102、MCCB103［30］及假單胞菌屬 W3［31］能產(chǎn)生抑制性化合物，從而抑制哈維氏弧菌（V．harveyi）及副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）等致病菌。此外，部分假單胞菌可以分泌一些酶，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。例如，分離于斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）腸道內(nèi)的假單胞菌屬PM11，可以通過(guò)分泌胞外消化酶促進(jìn)動(dòng)物消化［32］；銅綠假單胞菌K-187可以分泌幾丁質(zhì)酶和蛋白酶，促進(jìn)甲殼動(dòng)物蛻皮［33］。本研究中，隨著鹵蟲生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，鹵蟲生長(zhǎng)性能較好，推測(cè)可能與其腸道假單胞桿菌的增加有關(guān)。

微小桿菌CFR26M能分泌胞外蛋白酶利于蝦的脫殼及降解［34］，且微小桿菌 mexicanum 8N能產(chǎn)生利于消化的蛋白酶，促進(jìn)鹵蟲在惡劣的條件下存活和發(fā)育［35］。本研究中，隨鹵蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，微小桿菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢(shì)，與鹵蟲生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期變化一致，推測(cè)與鹵蟲所處發(fā)育時(shí)期的蛻皮行為有關(guān)。生長(zhǎng)第1天鹵蟲樣品（S2組）為后無(wú)節(jié)幼蟲期，生長(zhǎng)第5天鹵蟲樣品（S3組）為擬成蟲期，生長(zhǎng)第10天鹵蟲樣品（S4組）為成蟲期。鹵蟲從后無(wú)節(jié)幼蟲期變態(tài)發(fā)育至擬成蟲期，蛻皮間隔時(shí)間短，鹵蟲所受的刺激大；而從擬成蟲期變態(tài)發(fā)育至成蟲期，蛻皮間隔時(shí)間長(zhǎng)，鹵蟲所受的刺激小。

本研究測(cè)定的是室內(nèi)小規(guī)模養(yǎng)的鹵蟲樣品，其腸道菌群與自然條件生長(zhǎng)的或大規(guī)模培養(yǎng)的鹵蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)可能不同。因?yàn)閷?duì)餌料和培養(yǎng)條件的微生物控制，限制了環(huán)境的變化，減少了環(huán)境對(duì)動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響［36］，放大了遺傳對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為未來(lái)深入研究鹵蟲遺傳特性與其腸道菌群的相關(guān)性提供一定的理論依據(jù)。

4 小結(jié)

綜上，鹵蟲在無(wú)節(jié)幼蟲期、后無(wú)節(jié)幼蟲期、擬成蟲期、成蟲期4個(gè)發(fā)育時(shí)期的腸道菌群組成發(fā)生顯著變化，表明鹵蟲自身的生長(zhǎng)發(fā)育能夠影響其腸道菌群組成，未來(lái)將針對(duì)鹵蟲遺傳特性與其腸道菌群的相關(guān)性進(jìn)行深入研究，以期解析腸道菌群在鹵蟲生長(zhǎng)、蛻皮和免疫等方面的潛在影響作用。