茹文紅，鄭曉婷，段亞飛，董宏標，劉青松，張家松

（1．中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300；2．上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

鹵蟲（Artemia），又稱鹽水豐年蟲，隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda），有鰓亞門（Branchiata），甲殼綱（Crustacea），鰓足亞綱（Branchiopoda），鹽水豐年蟲科（Branchinectidae）。鹵蟲分布范圍極其廣泛，在世界許多碳酸鹽和硫酸鹽的自然湖泊和人工鹽池中均有分布［1］。鹵蟲的發(fā)育一般經(jīng)歷5個階段：卵（egg）、無節(jié)幼蟲期（nauplius stage）、后無節(jié)幼蟲期（metanauplius stage）、擬成蟲期（pseudo adult stage）和成蟲期（adult stage）。無節(jié)幼蟲期是指蛻皮0～1次的幼蟲，其身體不分節(jié)且經(jīng)歷一次蛻皮后消化道明顯可見，呈筒狀；后無節(jié)幼蟲期是指蛻皮2～5次的幼蟲，其胸部開始分節(jié)，消化道開始具備生理功能；擬成蟲期是指蛻皮6～10次的幼蟲，其外形與成體相似［2］。

鹵蟲具有營養(yǎng)豐富、個體小、生長周期短、繁殖速度快和易于在實驗室培養(yǎng)等優(yōu)點，被廣泛用于水產(chǎn)餌料［3］、生物載體［4］、發(fā)育生物學［5－6］、免疫學［7－9］和毒理學［10－11］等領域研究。目前，國內外對鹵蟲的研究主要集中在鹵蟲基礎生物學方面，如分類、卵特性、生長發(fā)育、繁殖習性以及在水產(chǎn)餌料中的應用等，而有關鹵蟲不同發(fā)育時期腸道菌群結構的研究報道較少。

動物腸道是消化吸收的主要場所，其中棲息著數(shù)量龐大的微生物，形成了一個復雜和相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生物能夠影響動物生長、消化吸收及健康［12］。研究表明，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）腸道內分離出的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能分泌多種胞外消化酶［13］；鮸魚（Miichthysmiiuy）腸道內分離出的不動桿菌屬（Acinetobacter）對有機質有較強分解能力［14］；草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道內檢測到的擬桿菌屬（Bacteroides）能夠為腸黏膜提供能量，可以促進腸黏膜的修復和生長［15］。因此，本研究以室內養(yǎng)殖的巴里坤鹵蟲（Artemia parthenogenetica）為研究對象，采用Illumina MiSep高通量測序技術研究無節(jié)幼蟲期、后無節(jié)幼蟲期、擬成蟲期和成蟲期4個時期腸道菌群結構，旨在為初步探究腸道菌群對鹵蟲不同發(fā)育時期個體生長、蛻皮、免疫等影響提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 供試材料

鹵蟲的休眠卵采自于西藏巴里坤湖（購于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司）。螺旋藻為科晶牌螺旋藻粉（購于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司），用之前高溫滅菌半小時［16］，再以滅過菌的人工海水制成懸濁液，現(xiàn)配現(xiàn)用。養(yǎng)殖期間所用的人工海水為海水晶（廣州市海神水族科技服務公司）與蒸餾水以3∶100比例混合配制，經(jīng)100目篩絹網(wǎng)過濾后，高壓滅菌的人工海水（鹽度30，pH值8．3）。

1．2 鹵蟲的孵化與培養(yǎng)

鹵蟲卵的消毒參照BARUAH［17］的方法并稍加修改進行。取鹵蟲卵400 mg，用蒸餾水浸泡并曝氣1 h。加入32%氫氧化鈉660μL和50%次氯酸鈉50 mL進行消毒100 s，然后加入10 g·L－1硫代硫酸鈉14 mL，孵育2 min。最后用人工海水洗滌至無色。將消毒脫殼的鹵蟲卵放入盛有60 mL人工海水的培養(yǎng)瓶中孵化24 h。孵化期間溫度30℃，鹽度30，pH 8．3，光照強度2 000 lx，使用0．22μm空氣過濾器過濾曝氣。整個孵化過程置于超凈工作臺中進行，孵化設置3個平行組。

將每個平行組孵化出來的鹵蟲無節(jié)幼蟲分別放于盛有800 mL人工海水的培養(yǎng)瓶中進行養(yǎng)殖，密度為4尾·mL－1（養(yǎng)殖與孵化條件一致）。每2 d換水一次，每次換水1／2。每天投喂餌料一次，投喂量為 8 mg·L－1［18－19］。整個培養(yǎng)過程置于超凈工作臺中進行。

1．3 樣品采集與處理

1．3．1 樣品的采集

分別在無節(jié)幼蟲期（S1，24 h）、后無節(jié)幼蟲期（S2，48 h）、擬成蟲期（S3，144 h）、成蟲期（S4，264 h）采集鹵蟲個體300、300、200、100尾。采集的樣品經(jīng)過處理后可用于腸道菌群測定，參照VERNER-JEFFREYS［20］和 NIU［21］的方法并稍加改進，具體操作為：無菌的條件下，利用鹵蟲的趨光性，用滅菌的吸管吸取鹵蟲個體，置于150目的網(wǎng)篩中，用滅菌海水沖洗3次；然后，在無菌的2 mL EP管中均質化，用于提取鹵蟲腸道菌群DNA。

1．3．2 DNA提取和16S rDNA宏基因組測序

利用EZNA?Stool DNA Kit試劑盒提取鹵蟲腸道菌群DNA。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測到清晰的 DNA條帶。用 Thermo Scientific微量核酸檢測儀NC2000檢測DNA的質量，得到 OD260／280＝1．99～2．00，符合 Illumina Misep測序要求。使用帶有測序條形碼標簽的引物 515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和 806R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）對細菌的 16S rDNA的V4-V5區(qū)進行擴增。

利用Q5?High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒進行PCR擴增，反應體系為25μL，包括5×Reaction Buffer 4μL，5×GC Buffer 5μL，2．5 mM dNTP 2μL，10μM（正反引物各 1μL），DNA Template 2μL，ddH2O 8．75μL，Q5High-Fidelity DNA Polymerase 0．25μL。反應程序為：98℃，2 min；（98℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s）×30個循環(huán)；72℃，5 min。PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并利用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）對目標片段進行切膠回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，定量儀器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx 800）。根據(jù)熒光定量結果，按照各樣本的測序量需求進行相應比例混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。制備好的文庫經(jīng)過Agilent Bioanalyzer質檢和Promega QuantiFluor熒光定量，確定文庫合格后，用Illumina MiSeq測序（北京微生太科技有限公司）。

1．4 測序結果處理與分析

1）將Illumina MiSeq高通量測序的原始下機數(shù)據(jù)根據(jù)堿基平均測序準確率進行初步篩查，利用 FLASH（V1．2．7，http：／／ccb．jhu．edu／software／FLASH／）對每個樣品Reads進行配對連接，去除嵌合體等疑問序列；2）使用QIIME軟件（Version 1．7．0），調用 UCLUST序列比對工具對獲得序列按97%序列相似度進行OTU歸并和劃分，將豐度值低于全體樣本測序總量0．001%（十萬分之一）OTU去除，選取每個OTU中豐度最高序列作為該OTU代表序列，然后將每個OTU代表序列與 Greengenes數(shù)據(jù)庫 （Release 13．8，http：／／greengenes．secondgenome．com／）進行比對，得到OTU各分類等級水平的注釋比例和物種相對豐度，為避免由于測序深度不同造成偏差，對各樣品數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)量最少樣品為標準進行均一化處理，根據(jù)各樣本 OTU數(shù)，使用 R軟件（Version 2．15．3）繪制 Venn圖；3）根據(jù) OTU劃分和分類地位鑒定結果，使用 R軟件（Version 2．15．3）繪制各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計圖，使用QIIME軟件（Version 1．7．0），獲取各樣本在門、綱、目、科、屬五個分類水平上的組成和豐度分布表，使用SIGMAPLOT 12．5繪制特定樣本在特定分類水平組成的柱狀圖；4）使用 QIIME軟件（Version 1．7．0）分別計算每個樣本 Simpson多樣性指數(shù)、Chao1豐富度估計指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、ACE豐富度估計指數(shù)及兩種Beta多樣性距離（Weighted Unifrac和 Unweighted Unifrac），使用R軟件（Version 2．15．3）繪制 Rarefaction稀釋曲線和PCoA圖；5）所得數(shù)據(jù)使用SPSS 17．0軟件中Duncan多重比較法進行單因素方差分析，以平均值±標準差（X±SD）表示，P＜0．05表示差異顯著。

2 結果與分析

2．1 Illum ina M iSeq測序結果

12個腸道細菌樣品采用Illumina MiSeq測序并優(yōu)化質控后共得到672 826條有效序列，每個樣品平均56 068條，長度主要為392～394 bp，平均為393 bp。鹵蟲4個不同發(fā)育時期的實驗組分別獲得339～647個不同的OTU?；?7%相似性水平劃分OTUs的稀釋曲線結果顯示，各個樣品的序列均達到40 000條以上時，曲線趨于平緩，表明樣品的序列測序數(shù)量可以有效覆蓋文庫（圖1）。

圖1 腸道菌群單個樣品中OTUs稀釋曲線Fig．1 Rarefaction curves for OTUs in each sam ple

2．2 腸道菌群多樣性

利用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指標評估鹵蟲不同發(fā)育時期腸道菌群的α多樣性。結果顯示，與S1組相比，S2、S3和S4組的α多樣性指數(shù)均顯著升高（P＜0．05），但3組之間不存在顯著性差異（P＞0．05）（表1）。

基于4組鹵蟲腸道菌群全部有效OTU數(shù)繪制的Venn圖（圖2）顯示，有效OTU共2105個，4組共有OTU169個。其中，S3組特有OTU最多，為83個；其次為S4組、S1組和S2組，分別為82、35和30個?；趙eighted和unweighted UniFrac距離的PCoA分析顯示，4組鹵蟲腸道菌群結構存在一定的差異（圖3）。

2．3 腸道菌群結構組成變化

在門分類水平上變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在4組鹵蟲腸道菌群的相對豐度均達到94%以上，為優(yōu)勢菌群。其中，4組間變形菌門的相對豐度無顯著性差異（P＞0．05）；S1、S2和S3組間厚壁菌門的相對豐度無顯著性差異（P＞0．05），與 S3組相比，S4組厚壁菌門的相對豐度顯著減少（P＜0．05）。此外，4組擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度呈顯著增加趨勢（P＜0．05）（圖4）。

表1 巴里坤鹵蟲腸道菌群α多樣性指數(shù)Tab．1 α-diversity of intestinem icrobiota in Artem ia parthenogenetica

圖2 巴里坤鹵蟲腸道共有OTU分析圖Fig．2 Shared OTU analysis of intestinem icrobiota in Artem ia parthenogenetica

在綱分類水平上共有8個菌綱的相對豐度≥ 0． 50% （圖 5）。 γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、 α-變 形 菌 綱（Alphaproteobacteria）及芽孢桿菌綱（Bacilli）為優(yōu)勢菌群。α-變形菌綱在S1組中占絕對優(yōu)勢，相對豐度為51．1%；與S1組對比，其相對豐度在S2、S3和S4組中顯著減少（P＜0．05）。與 S1組相比，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）在 S2、S3和S4組中的相對豐度顯著增加（P＜0．05）。

在屬分類水平上共有19個菌屬的相對豐度≥0．10% （圖 6）。結 果 顯 示，副 球 菌 屬（Paracoccus）在S1組中的相對豐度占絕對優(yōu)勢，其在S2、S3和 S4組中顯著減少（P＜0．05）。假單胞桿菌屬（Pseudomonas）和交替赤桿菌屬（Altererythrobacter）的相對豐度在4組中逐漸增加，而微小桿菌屬（Exiguobacterium）的相對豐度呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢。鹽單胞桿菌屬（Halomonas）的相對豐度在S1和S2組中無變化（P＞0．05），而在 S3組中顯著減少（P＜0．05）。嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的相對豐度在S2和S3組中顯著增加（P＜0．05），而在S4組中顯著減少（P＜0．05）。短波單胞菌屬（Brevundimonas）的相對豐度在4組間存在顯著差異（P＜0．05）。對于稀有菌屬（Limnobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、小紅卵菌屬（Rhodovulum）和普氏菌屬 9（Prevotella9）的相對豐度在4組中逐漸增加，而赤桿菌屬（Erythrobacter）和鞘脂菌屬（Sphingobium）的相對豐度在4組中逐漸減少。

圖3 巴里坤鹵蟲腸道菌群PCoA分析Fig．3 Principal coordinates analysis（PCoA）of the intestinem icrobial communities in different samp les

圖4 腸道菌群門水平相對豐度Fig．4 Relative abundance of intestinem icrobiota at the phylum level

圖5 腸道菌群綱水平相對豐度Fig．5 Relative abundance of intestinem icrobiota at the class level

圖6 腸道菌群屬水平相對豐度Fig．6 Relative abundance of intestinem icrobiota at the genus level

3 討論

本研究利用Illumina MiSep高通量測序技術，在不同分類水平上對巴里坤鹵蟲不同發(fā)育階段的腸道菌群組成及變化規(guī)律進行了分析。結果表明，鹵蟲在不同發(fā)育時期的腸道菌群組成不斷發(fā)生變化。從α多樣性指數(shù)和PCoA圖可以看出，隨著鹵蟲的正常發(fā)育，其各生長時期的腸道菌群多樣性增加，群落結構復雜化，與多佛比目魚（Solea solea）［22］研究結果一致。CAMPBELL等［22］研究了多佛比目魚不同發(fā)育時期的腸道菌群變化，結果表明，其成魚期腸道菌群組成比仔魚期豐富。相關研究表明，動物自身的生長時期及健康狀況能夠影響其腸道菌群組成［23］，其可能是造成鹵蟲不同發(fā)育時期腸道菌群存在差異的主要原因。

隨著鹵蟲的生長發(fā)育，擬桿菌門和放線菌門細菌逐漸增加。研究表明，擬桿菌門細菌能夠吸收和降解有機物質，降解多種生物聚合物如纖維素和幾丁質［24－25］。此外，擬桿菌門細菌還能利用腸道內植物來源的底物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為宿主腸道提供能量，促進不可消化組分的能量攝入最大化［26］。因此，本研究中擬桿菌門細菌的增加可能與其促進鹵蟲消化植物性食物有關。放線菌門細菌能夠產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，其中許多是有效的抗生素，能夠提高動物的抗病能力［27］。在綱分類水平上，α-變形菌綱細菌為無節(jié)幼蟲期鹵蟲腸道優(yōu)勢菌群，其后γ-變形菌綱細菌的相對豐度升高，變?yōu)閮?yōu)勢菌群，表明鹵蟲的生長發(fā)育期間，其腸道內的優(yōu)勢菌群發(fā)生了更替。究其原因，在屬分類水平上α-變形菌綱中的副球菌屬細菌相對豐度顯著減少（P＜0．05），而γ-變形菌綱中的假單胞桿菌相對豐度顯著增加（P＜0．05）。

在屬分類水平上，假單胞菌屬細菌隨鹵蟲的生長發(fā)育進程其相對豐度從0．7%顯著增加到24．3%（P＜0．05）。研究表明，假單胞菌屬為水產(chǎn)動物腸道中常見的菌屬［28］，其中部分細菌能夠有效抑制致病菌。例如，熒光假單胞菌AH2能夠抑制鰻弧菌（Vibrio anguillarum）以降低虹鱒（Oncorynchus mykiss）的 死亡 率［29］；假 單 胞 菌MCCB102、MCCB103［30］及假單胞菌屬 W3［31］能產(chǎn)生抑制性化合物，從而抑制哈維氏弧菌（V．harveyi）及副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）等致病菌。此外，部分假單胞菌可以分泌一些酶，促進動物生長。例如，分離于斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）腸道內的假單胞菌屬PM11，可以通過分泌胞外消化酶促進動物消化［32］；銅綠假單胞菌K-187可以分泌幾丁質酶和蛋白酶，促進甲殼動物蛻皮［33］。本研究中，隨著鹵蟲生長發(fā)育的進行，鹵蟲生長性能較好，推測可能與其腸道假單胞桿菌的增加有關。

微小桿菌CFR26M能分泌胞外蛋白酶利于蝦的脫殼及降解［34］，且微小桿菌 mexicanum 8N能產(chǎn)生利于消化的蛋白酶，促進鹵蟲在惡劣的條件下存活和發(fā)育［35］。本研究中，隨鹵蟲的生長發(fā)育，微小桿菌屬的相對豐度呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢，與鹵蟲生長發(fā)育時期變化一致，推測與鹵蟲所處發(fā)育時期的蛻皮行為有關。生長第1天鹵蟲樣品（S2組）為后無節(jié)幼蟲期，生長第5天鹵蟲樣品（S3組）為擬成蟲期，生長第10天鹵蟲樣品（S4組）為成蟲期。鹵蟲從后無節(jié)幼蟲期變態(tài)發(fā)育至擬成蟲期，蛻皮間隔時間短，鹵蟲所受的刺激大；而從擬成蟲期變態(tài)發(fā)育至成蟲期，蛻皮間隔時間長，鹵蟲所受的刺激小。

本研究測定的是室內小規(guī)模養(yǎng)的鹵蟲樣品，其腸道菌群與自然條件生長的或大規(guī)模培養(yǎng)的鹵蟲腸道菌群結構可能不同。因為對餌料和培養(yǎng)條件的微生物控制，限制了環(huán)境的變化，減少了環(huán)境對動物腸道菌群結構的影響［36］，放大了遺傳對腸道菌群結構的影響，為未來深入研究鹵蟲遺傳特性與其腸道菌群的相關性提供一定的理論依據(jù)。

4 小結

綜上，鹵蟲在無節(jié)幼蟲期、后無節(jié)幼蟲期、擬成蟲期、成蟲期4個發(fā)育時期的腸道菌群組成發(fā)生顯著變化，表明鹵蟲自身的生長發(fā)育能夠影響其腸道菌群組成，未來將針對鹵蟲遺傳特性與其腸道菌群的相關性進行深入研究，以期解析腸道菌群在鹵蟲生長、蛻皮和免疫等方面的潛在影響作用。