馬杭柯，孫金秋，徐莞媛，閻斌倫，2，3，4，高 煥，2，3，4

（1．江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005；2．江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222001；3．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），連云港 222005；4．江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014）

基因編輯技術(shù)是在DNA水平，通過刪除、插入等方式對DNA特定序列進(jìn)行改造的技術(shù)。在CRISPR／Cas9技術(shù)出現(xiàn)以前，人們主要通過鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc-finger nuclease，ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector，TALENs）來實(shí)現(xiàn)編輯基因的功能。鋅指核酸酶和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶都是由特異DNA結(jié)合蛋白與DNA核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域組成。這些核酸酶可以在特定位點(diǎn)對 DNA進(jìn)行切割，形成雙鏈斷裂（double strand break，DSB），隨后在非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或者同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)機(jī)制下實(shí)現(xiàn)基因編輯［1］。ZFN和TALEN技術(shù)提高了打靶效率，降低了安全風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)了對基因組的定點(diǎn)編輯。然而，對ZFN和TALEN的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造需要花費(fèi)大量人力物力，成本昂貴，使其應(yīng)用受到很大限制［2］。CRISPR／Cas9的出現(xiàn)很好地解決了上述方法存在的問題，為基因編輯提供了一把精確的手術(shù)刀，可以對目的序列進(jìn)行更簡便、廉價(jià)的編輯［3］。

目前，CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于各類陸生生物，包括對擬南芥（Arabidopsis thaliana）多種細(xì)胞進(jìn)行突變［4］、利用小鼠（Musmusculus）進(jìn)行癌癥建模［5］、選育水稻（Oryza sativa）新型品種［6］、改造豬（Sus scrofa）多能干細(xì)胞［7］、治療人類（Homo sapiens）基因疾?。?］等，同時(shí)，水生生物中該技術(shù)也開始得到應(yīng)用，如在斑馬魚（Danio rerio）［9］、七鰓鰻（Lampetra japonica）［10］等物種中均已成功實(shí)現(xiàn)基因編輯。本文就CRISPR基因編輯技術(shù)目前的研究進(jìn)展及其在水生生物中的相關(guān)應(yīng)用展開綜述，以期為科研工作者們在水生生物研究中進(jìn)一步應(yīng)用該技術(shù)提供幫助。

1 CRISPR／Cas

1．1 CRISPR／Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷程

CRISPR存在于40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中，是細(xì)菌抵御外界入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，可以識別、整合并切除外源 DNA［11－13］。早在 1987年，ISHINO等［14］在對大腸桿菌基因組進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)其堿性磷酸酶附近存在串聯(lián)間隔重復(fù)序列。2002年，JANSEN等［15］正式將此種結(jié)構(gòu)定義為 CRISPR。2006年，有 研 究 人 員［16］預(yù) 測CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能。根據(jù)此預(yù)測，BARRANGOU等［11］于2007年首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可能利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵。隨后，MARRAFFNI等［17］發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。直至2012年，JINEK等［18］利用II型的CRISPR／Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了DNA特異性位點(diǎn)的雙鏈斷裂，是CRISPR／Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因組定點(diǎn)編輯的開端。由此之后，CRISPR技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于各種物種甚至在人體內(nèi)也進(jìn)行了基因編輯實(shí)驗(yàn)［19］。

1．2 CRISPR／Cas系統(tǒng)的分類與結(jié)構(gòu)

CRISPR／Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的差異可以分為3類［20］：第一類是多個(gè)蛋白同crRNA結(jié)合成復(fù)合物，在 PAM（protospacer adjacentmotifis）元件的輔助下，使Cas3蛋白可以精確區(qū)分需要降解的外源DNA與序列完全相同的自身DNA，從而實(shí)現(xiàn)對外源DNA的識別與切除；第二類則是在PAM元件的輔助下，由Cas9蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切；第三類不需要PAM參與，主要由Cas10蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切。其中第二類CRISPR／Cas9系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌中，但相比于其它類型的復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合體，其只需要Cas9蛋白參與，結(jié)構(gòu)與操作更加簡潔，是目前主要運(yùn)用的類型。

以第二類型為例（圖1），其CRISPR／Cas9系統(tǒng)主要包括 5′端 tracrRNA（trans-activating crRNA），一系列Cas蛋白編碼基因，以及3′端的CRISPR基因。其中5′端tracrRNA可以與crRNA形成復(fù)合物，幫助 Cas9蛋白識別并切割外源DNA。3′端的CRISPR基因位點(diǎn)其序列由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)（Leader）、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)（Repeat）和多個(gè)間隔區(qū)（Spacer）組成［21］。前導(dǎo)區(qū)一般處于CRISPR位點(diǎn)上游，通常由300～500 bp堿基組成，富含AT堿基。此區(qū)域在同種內(nèi)高度保守，但是種間差別較大。余下部分則由多段25～50 bp長度的高度保守的重復(fù)序列和26～72 bp長度的間隔片段互相串聯(lián)而成［22］。在一個(gè)CRISPR位點(diǎn)中，重復(fù)序列是高度保守的，5′端和3′端 部 分 尤 為 保 守，分 別 為 GTTT／g和GAAAC［23］，而間隔區(qū)卻幾乎沒有相似的序列存在，可能因?yàn)樗菍Σ煌《綝NA整合后留下的殘余，作用是獲得對不同病毒的免疫記憶能力。

1．3 CRISPR／Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制

同樣以第二類型CRISPR／Cas9系統(tǒng)為例（圖1），其作用主要分為3個(gè)階段，分別是新的間隔序列的獲得、crRNA的成熟以及Cas9蛋白對外源DNA的切割。第一階段也可以理解為適應(yīng)，即噬菌體或質(zhì)粒第一次侵染時(shí)，其一小段DNA序列會被Cas1和Cas2蛋白整合到CRISPR位點(diǎn)的前導(dǎo)區(qū)和第一個(gè)重復(fù)序列之間，并重新復(fù)制一個(gè)重復(fù)序列，形成新的重復(fù)-間隔單元，從而保存了外源DNA的序列信息，為適應(yīng)性免疫奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)同類噬菌體再次進(jìn)入有適應(yīng)性的細(xì)菌時(shí)，重復(fù)序列會截取和保留入侵噬菌體的某些DNA形成間隔序列，隨后轉(zhuǎn)錄成前體crRNA，經(jīng)Cas蛋白切割成成熟crRNA（包含一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列）后與 tracrRNA形成雙鏈二級結(jié)構(gòu)［24－25］并吸引Cas9蛋白形成復(fù)合體，隨后在PAM序列的幫助下，即可使靶DNA序列中PAM下游3 bp處的雙鏈均斷裂。

因此，由以上機(jī)制引導(dǎo)，只需要人工合成特異性crRNA并將其成功轉(zhuǎn)入合適的質(zhì)粒中，與表達(dá)tracrRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒共侵染細(xì)胞，就可以得到特異性基因敲除的細(xì)胞系或者動物模型。為了操作更加簡便，JINEK等［18］以一段更加簡單的單鏈引導(dǎo) RNA（sgRNA）替代 crRNA和tracrRNA組成的雙鏈RNA復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)其同樣可以與Cas9蛋白結(jié)合并切割DNA雙鏈。因此，也可以直接將sgRNA同Cas9RNA混合后以顯微注射法導(dǎo)入受體受精卵，大大簡化了繁瑣的操作。

2 CRISPR／Cpf1

CRISPR／Cas技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，無疑把基因編輯領(lǐng)域的研究帶上了高峰，然而CRISPR／Cas技術(shù)也存在著脫靶效應(yīng)等許多問題，使其至今難以應(yīng)用于人類基因編輯。研究者繼續(xù)對CRISPR家族進(jìn)行深度挖掘，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了具有更高基因編輯效率的Cpf1蛋白［27］。CRISPR／Cpf1系統(tǒng)根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能被定義為Ⅱ類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)。其Cpf1蛋白為三角型單體，未與crRNA結(jié)合時(shí)處于較為松散的狀態(tài)，一旦與crRNA結(jié)合便顯著改變其構(gòu)象，從而具有切割目的序列的能力［28］。人們發(fā)現(xiàn)Cpf1蛋白在某些菌中與Cas9蛋白同時(shí)存在，但是 CRISPR／Cpf1系統(tǒng)的作用機(jī)制與CRISPR／Cas9卻有較大的不同。Cas9來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），而 Cpf1蛋白［29］來自于新兇手弗朗西斯菌（Francisella novicida）、氨基酸球菌（Acidaminococcus）和毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium），其來源更廣泛，且具有更小的分子量，顯示了它在包裝和運(yùn)輸方面的優(yōu)越性。CRISPR／Cas9系統(tǒng)需要tracrRNA與crRNA結(jié)合成RNA二聚體，并經(jīng)過RNaseⅢ加工完善，方可識別目的序列，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行切割；而CRISPR／Cpf1系統(tǒng)僅需要一段42～44nt的crRNA參與即可，大大減少了實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與操作流程，降低了實(shí)驗(yàn)的成本與風(fēng)險(xiǎn)。此外，兩個(gè)系統(tǒng)均依靠 PAM序列對目的序列進(jìn)行識別，但Cpf1識別 5′端的 TTN序列，Cas9識別 3′端的NGG序列。Cpf1蛋白剪切位點(diǎn)離PAM序列較遠(yuǎn)，有更多的位點(diǎn)供選擇編輯；同時(shí)NHEJ修復(fù)時(shí)不會改變PAM臨近序列，Cpf1蛋白可以再次識別與切割靶序列，提高了基因編輯的效率。而且CRISPR／Cpf1系統(tǒng)切割后留下粘性末端，提高了外源基因的整合效率，這在同源重組率較低的實(shí)驗(yàn)對象中有更大的意義。

圖1 化膿鏈球菌CRISPR／Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制［26］Fig．1 Structure and mechanism of CRISPR／Cas9 system of Streptococcus pyogenes CRISPR／Cas9

圖2 CRISPR／Cas9及 CRISPR／Cp f1系統(tǒng)示意圖［30］Fig．2 CRISPR／Cas9 and CRISPR／Cpf1 system

盡管CRISPR／Cpf1技術(shù)于2015年才發(fā)現(xiàn)，但其目前已經(jīng)在大腸桿菌（Escherichia coli）、小鼠、果蠅（Drosophila melahogaster）等多種模式生物中實(shí)現(xiàn)基因編輯，并且成果顯著。HU等［31］于2017年初成功實(shí)現(xiàn)了LbCpf1對水稻基因組的編輯，發(fā)現(xiàn)突變率與靶基因有一定關(guān)系，而AsCpf1并不能運(yùn)用于水稻編輯。2017年4月，WANG等［32］用CRISPR／Cpf1技術(shù)對水稻的編輯得出了相類似的結(jié)論，同時(shí)發(fā)現(xiàn)FnCpf1也可用于水稻的編輯，但效率比LbCpf1低。CRISPR／Cpf1技術(shù)還有一個(gè)重要的優(yōu)勢是脫靶率低。2016年，有兩項(xiàng)研究［33－34］對 CRISPR／Cpf1技術(shù)在人體中編輯時(shí)的脫靶率做了評估，結(jié)果都表明 LbCpf1和AsCpf1在人體基因組上的潛在脫靶位點(diǎn)比Cas9編輯時(shí)更少，且脫靶位點(diǎn)的基因突變頻率也低于1%，遠(yuǎn)低于靶位點(diǎn)的突變頻率。

CRISPR／Cpf1技術(shù)在某些方面比 CRISPR／Cas9更具優(yōu)勢，也取得了許多相關(guān)成就，但其研究還不夠深入，實(shí)際應(yīng)用比較少，目前期待更多的科研工作者將其發(fā)掘改造，使其成為更適合于生物體基因編輯的工具。

3 基因編輯技術(shù)的比較

ZFNs、TALENs和 CRISPR／Cas9技術(shù)都可以進(jìn)行基因編輯。理論上，ZFNs可以針對任何序列編輯，但其需要構(gòu)建龐大的鋅指表達(dá)文庫，成本昂貴，且脫靶率很高，容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使其應(yīng)用受到限制。TALENs技術(shù)比ZFNs有所改進(jìn)，但是構(gòu)建周期長，成本較高，且識別位點(diǎn)受到胸腺嘧啶的制約，難以進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯。CRISPR／Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)簡單，成本低廉，構(gòu)建周期短，可以進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯且靶向修飾效率高，但仍存在脫靶率不確定等問題。

4 CRISPR技術(shù)在水生生物中的應(yīng)用

4．1 模式生物與疾病模型的構(gòu)建

傳統(tǒng)模式生物的構(gòu)建依賴于ES細(xì)胞，而新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)打破了這一局限，高效簡潔的新技術(shù)甚至可以重新定義新的模式生物。斑馬魚因?yàn)槠湫误w小巧透明，體外受精，發(fā)育迅速，成本低廉，而且其疾病生理與基因組與人類相似度高，主要信號同通路與基因具有高同源性，逐步成為僅次于小鼠的第二優(yōu)先模式脊椎動物?，F(xiàn)在有很多的科學(xué)家運(yùn)用CRISPR／Cas9技術(shù)編輯改造斑馬魚基因，并且成功獲得了一批基因缺失的疾病模型。比如，將斑馬魚lncRNA基因啟動子敲除可以探究lncRNA基因?qū)Π唏R魚的調(diào)控，對于人類腫瘤研究具有很好的借鑒價(jià)值［35］。此外還有UROD基因敲除的人類卟啉癥斑馬魚疾病模型和血紅蛋白hae3基因缺失的斑馬魚模型［36］等。斑馬魚器官都具有強(qiáng)大的恢復(fù)能力，如果可以將基因編輯技術(shù)運(yùn)用于此，以解析其再生能力的調(diào)控機(jī)制，甚至找到關(guān)鍵基因，無疑將成為人類器官疾病患者的福音。玻璃海鞘（Ciona intestinalis）也被視作一種海洋模式生物，目前建立的Hox基因變異與ebf基因缺失的玻璃海鞘模型，主要用于探究脊索動物身體形成的分子機(jī)制［37－38］。此外，科研工作者還建立藻類［39］等眾多海洋生物模型，以此探究海洋生物的起源與進(jìn)化路程，促進(jìn)了海洋生命的探索與發(fā)現(xiàn)。

4．2 基因功能的解析與篩選

對未知基因的功能進(jìn)行探索是了解生命的必要進(jìn)程，但運(yùn)用傳統(tǒng)技術(shù)解析基因功能艱難而又緩慢，無法滿足當(dāng)今科學(xué)探索的需求。CRISPR／Cas9技術(shù)的高效切割、精確修飾使其成為基因功能解析的先進(jìn)工具。許多科研工作者嘗試運(yùn)用CRISPR／Cas9技術(shù)對生長發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。他們發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚的RFX6基因敲除后，其純和突變體生長緩慢且無法繁育后代，證實(shí)了RFX6基因?qū)Π唏R魚胰腺發(fā)育的重要性［40］；敲除尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的dmrt1和Foxl2基因，其精巢與卵母細(xì)胞生長被抑制，驗(yàn)證了dmrt1和Foxl2基因?qū)α_非魚發(fā)育的作用［41］；運(yùn)用 CRISPR／Cas9技術(shù)切除熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）six3基因，得到了six3基因參與爪蟾眼睛和大腦形成的結(jié)論［42］。隨后，有科研工作者對熒光顯色基因進(jìn)行了研究，他們利用CRISPR技術(shù)敲除?？∟ematostella vectehsis）的NvFP-7R基因，得到不能發(fā)出紅色熒光的變異體?？挥掷?CRISPR技術(shù)為大西洋角螺（Crepidula forhicata）添加了一段編碼熒光蛋白的序列，得到了可以檢測到熒光蛋白的大西洋角螺的幼 體［43－44］。針 對某些基因 的 比 較 研究，MARTIN［45］、孫曉晴［46］分析了不同甲殼動物的Hox基因，探究了其對于生物多態(tài)性的功能的異同。LIN等［47］則對太平洋海膽（Strongylocentrotus purpuratus）的眾多節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行了比較篩選?？蒲泄ぷ髡邆兂藢π∑鹊奈粗蜻M(jìn)行解鎖外，還在一條染色體上設(shè)計(jì)一對Cas9蛋白位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了至多百萬堿基的大片段切割［48］。在同一條染色體上，利用CRISPR／Cas9技術(shù)敲除大片段往往有更高的效率，有利于對基因功能的探索。

4．3 水生生物經(jīng)濟(jì)新品種的選育

海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，尤其是魚蝦貝蟹，與人們的生活生產(chǎn)息息相關(guān)，而培育優(yōu)質(zhì)品種是促進(jìn)海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要方法之一。運(yùn)用新型基因編輯技術(shù)顯著地縮短了育種時(shí)間，通過目的基因的切除與導(dǎo)入，培育了一大批優(yōu)秀的轉(zhuǎn)基因海產(chǎn)品。新型基因編輯技術(shù)不僅可以敲除基因，還可以高效、定向地導(dǎo)入目的基因，這項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用于新品種的選育，較之傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加安全。這些新品種具有較快的生長速度，強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)性，創(chuàng)造了巨大的財(cái)富。目前，新型基因編輯技術(shù)在海淡水經(jīng)濟(jì)品種中的應(yīng)用主要還在實(shí)驗(yàn)階段，較為成功的有淺膚色的新品種大西洋鮭 （Salmo salar）［49］、青鳉 （Oryzias latipes latipes）［50］等。此外，有團(tuán)隊(duì)利用 CRISPR／Cas9技術(shù)編輯了脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因，并計(jì)劃對更多的基因進(jìn)行改造，以期獲得更高產(chǎn)率的新品種［51］。這些都是目前很少的關(guān)于CRISPR應(yīng)用于海洋經(jīng)濟(jì)品種的報(bào)告，都為水生生物經(jīng)濟(jì)新品種的選育提供了思路與參考。

受到“雙肌?！钡膯l(fā)，人們培養(yǎng)了一批肌肉生長抑制素基因缺失或替換的不同品種魚，這些魚大多具有高肌肉、低脂肪的特性，有望成為具有較高培育價(jià)值的新品種。除此之外，還可以改造基因獲得一些觀賞性品種，比如觀賞魚蝦等。

4．4 水生生物疾病調(diào)控

除了高產(chǎn)量、高品質(zhì)的新品種研發(fā)，還可以從疾病控制方面考慮，篩選出一批抗病、適應(yīng)性強(qiáng)的新品種。許多疾病都與基因有關(guān)，目前已經(jīng)證明CRISPR／Cas9技術(shù)可以用于識別疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)控元件［52］，這項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用于水生生物，可以探究其疾病發(fā)生原理，控制疾病的爆發(fā)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，病毒性疾病一旦爆發(fā)，難以抑制，往往造成重大經(jīng)濟(jì)損失，CRISPR可以記憶并識別外源入侵DNA［24］，可以以此獲得免疫DNA病毒的生物體。白斑綜合征一直是蝦類養(yǎng)殖減產(chǎn)的最重要因素之一，將白斑綜合征病毒基因的特異sgRNA和Cas9蛋白的編碼序列整合到蝦基因中，有望獲得免疫白斑病毒的新品種蝦。

4．5 海洋藥物研發(fā)

海洋生物可以分泌許多具有不同生物活性的物質(zhì)，其中相當(dāng)一部分都有重要的藥用價(jià)值，是具有理想療效的抗腫瘤、抗病毒、抗菌藥物，但其含量甚微，價(jià)格昂貴，不能滿足大多數(shù)疾病患者的需求。將這些稀有昂貴的藥物基因轉(zhuǎn)入特殊載體或者產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖生物中表達(dá)，不僅可以獲得藥物，而且可以提升產(chǎn)量，解決了藥物不足，價(jià)格昂貴等問題。已有科研工作者嘗試將相關(guān)基因提取出來，運(yùn)用CRISPR／Cas9技術(shù)導(dǎo)入海藻等超大規(guī)模養(yǎng)殖生物，或獲得指定類型的斑馬魚胚胎和幼苗進(jìn)行了小分子藥物篩選，以解決部分海洋藥源問題［53］。在海洋新藥研發(fā)過程中，最重要的是藥物與靶點(diǎn)之間的驗(yàn)證，而耐藥性突變位點(diǎn)往往與靶點(diǎn)有重要的關(guān)聯(lián)，因此可以在野生型背景的細(xì)胞中引入耐藥性突變點(diǎn)，以此驗(yàn)證靶點(diǎn)的可靠性［54］，同時(shí)將 CRISPR／Cas9技術(shù)與全基因組測序及耐藥性突變篩選結(jié)合，大大提高了靶點(diǎn)驗(yàn)證的效率［55］。

5 問題與展望

新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)再次激發(fā)了生物研究科技工作者們在基因水平改造生物的研究熱情，但其還遠(yuǎn)未盡善盡美。首先，新型基因編輯技術(shù)本身還存在技術(shù)上不完善的地方，如經(jīng)CRISPR／Cas9基因編輯后的小鼠經(jīng)全基因組檢測表明存在上千個(gè)無法控制的預(yù)測和控制的突變［56］，即 使 CRISPR／Cpf1 系 統(tǒng) 脫 靶 率 比CRISPR／Cas9低，但也容易產(chǎn)生嵌合體；其次，新型基因編輯技術(shù)的應(yīng)用還受到材料本身的很多限制，如對水生生物的甲殼類生物而言，顯微注射后的卵在孵化成功率上還有待進(jìn)一步提高［51］。任何技術(shù)都是從不完善慢慢走向成熟和完善，我們有理由相信，在眾多科研工作者們開始大量展開新型基因編輯技術(shù)應(yīng)用的過程中，上述問題會逐步得到有效地解決。