馬杭柯，孫金秋，徐莞媛，閻斌倫，2，3，4，高 煥，2，3，4

（1．江蘇省海洋生物技術重點實驗室，淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院，連云港 222005；2．江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222001；3．江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），連云港 222005；4．江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，南京 210014）

基因編輯技術是在DNA水平，通過刪除、插入等方式對DNA特定序列進行改造的技術。在CRISPR／Cas9技術出現(xiàn)以前，人們主要通過鋅指核酸酶技術（Zinc-finger nuclease，ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶技術（transcription activator-like effector，TALENs）來實現(xiàn)編輯基因的功能。鋅指核酸酶和類轉錄激活因子效應物核酸酶都是由特異DNA結合蛋白與DNA核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結構域組成。這些核酸酶可以在特定位點對 DNA進行切割，形成雙鏈斷裂（double strand break，DSB），隨后在非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）或者同源重組（homologous recombination，HR）修復機制下實現(xiàn)基因編輯［1］。ZFN和TALEN技術提高了打靶效率，降低了安全風險，實現(xiàn)了對基因組的定點編輯。然而，對ZFN和TALEN的結構域進行改造需要花費大量人力物力，成本昂貴，使其應用受到很大限制［2］。CRISPR／Cas9的出現(xiàn)很好地解決了上述方法存在的問題，為基因編輯提供了一把精確的手術刀，可以對目的序列進行更簡便、廉價的編輯［3］。

目前，CRISPR基因編輯技術已經(jīng)運用于各類陸生生物，包括對擬南芥（Arabidopsis thaliana）多種細胞進行突變［4］、利用小鼠（Musmusculus）進行癌癥建模［5］、選育水稻（Oryza sativa）新型品種［6］、改造豬（Sus scrofa）多能干細胞［7］、治療人類（Homo sapiens）基因疾病［8］等，同時，水生生物中該技術也開始得到應用，如在斑馬魚（Danio rerio）［9］、七鰓鰻（Lampetra japonica）［10］等物種中均已成功實現(xiàn)基因編輯。本文就CRISPR基因編輯技術目前的研究進展及其在水生生物中的相關應用展開綜述，以期為科研工作者們在水生生物研究中進一步應用該技術提供幫助。

1 CRISPR／Cas

1．1 CRISPR／Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷程

CRISPR存在于40%的細菌和90%的古細菌中，是細菌抵御外界入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，可以識別、整合并切除外源 DNA［11－13］。早在 1987年，ISHINO等［14］在對大腸桿菌基因組進行研究時，發(fā)現(xiàn)其堿性磷酸酶附近存在串聯(lián)間隔重復序列。2002年，JANSEN等［15］正式將此種結構定義為 CRISPR。2006年，有 研 究 人 員［16］預 測CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能。根據(jù)此預測，BARRANGOU等［11］于2007年首次發(fā)現(xiàn)并證明細菌可能利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵。隨后，MARRAFFNI等［17］發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉移。直至2012年，JINEK等［18］利用II型的CRISPR／Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了DNA特異性位點的雙鏈斷裂，是CRISPR／Cas9系統(tǒng)應用于基因組定點編輯的開端。由此之后，CRISPR技術開始廣泛應用于各種物種甚至在人體內(nèi)也進行了基因編輯實驗［19］。

1．2 CRISPR／Cas系統(tǒng)的分類與結構

CRISPR／Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的差異可以分為3類［20］：第一類是多個蛋白同crRNA結合成復合物，在 PAM（protospacer adjacentmotifis）元件的輔助下，使Cas3蛋白可以精確區(qū)分需要降解的外源DNA與序列完全相同的自身DNA，從而實現(xiàn)對外源DNA的識別與切除；第二類則是在PAM元件的輔助下，由Cas9蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切；第三類不需要PAM參與，主要由Cas10蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切。其中第二類CRISPR／Cas9系統(tǒng)僅存在于細菌中，但相比于其它類型的復雜蛋白質(zhì)復合體，其只需要Cas9蛋白參與，結構與操作更加簡潔，是目前主要運用的類型。

以第二類型為例（圖1），其CRISPR／Cas9系統(tǒng)主要包括 5′端 tracrRNA（trans-activating crRNA），一系列Cas蛋白編碼基因，以及3′端的CRISPR基因。其中5′端tracrRNA可以與crRNA形成復合物，幫助 Cas9蛋白識別并切割外源DNA。3′端的CRISPR基因位點其序列由一個前導區(qū)（Leader）、多個短而高度保守的重復序列區(qū)（Repeat）和多個間隔區(qū)（Spacer）組成［21］。前導區(qū)一般處于CRISPR位點上游，通常由300～500 bp堿基組成，富含AT堿基。此區(qū)域在同種內(nèi)高度保守，但是種間差別較大。余下部分則由多段25～50 bp長度的高度保守的重復序列和26～72 bp長度的間隔片段互相串聯(lián)而成［22］。在一個CRISPR位點中，重復序列是高度保守的，5′端和3′端 部 分 尤 為 保 守，分 別 為 GTTT／g和GAAAC［23］，而間隔區(qū)卻幾乎沒有相似的序列存在，可能因為它是對不同病毒DNA整合后留下的殘余，作用是獲得對不同病毒的免疫記憶能力。

1．3 CRISPR／Cas系統(tǒng)的作用機制

同樣以第二類型CRISPR／Cas9系統(tǒng)為例（圖1），其作用主要分為3個階段，分別是新的間隔序列的獲得、crRNA的成熟以及Cas9蛋白對外源DNA的切割。第一階段也可以理解為適應，即噬菌體或質(zhì)粒第一次侵染時，其一小段DNA序列會被Cas1和Cas2蛋白整合到CRISPR位點的前導區(qū)和第一個重復序列之間，并重新復制一個重復序列，形成新的重復-間隔單元，從而保存了外源DNA的序列信息，為適應性免疫奠定了基礎。當同類噬菌體再次進入有適應性的細菌時，重復序列會截取和保留入侵噬菌體的某些DNA形成間隔序列，隨后轉錄成前體crRNA，經(jīng)Cas蛋白切割成成熟crRNA（包含一個間隔序列和部分重復序列）后與 tracrRNA形成雙鏈二級結構［24－25］并吸引Cas9蛋白形成復合體，隨后在PAM序列的幫助下，即可使靶DNA序列中PAM下游3 bp處的雙鏈均斷裂。

因此，由以上機制引導，只需要人工合成特異性crRNA并將其成功轉入合適的質(zhì)粒中，與表達tracrRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒共侵染細胞，就可以得到特異性基因敲除的細胞系或者動物模型。為了操作更加簡便，JINEK等［18］以一段更加簡單的單鏈引導 RNA（sgRNA）替代 crRNA和tracrRNA組成的雙鏈RNA復合體，發(fā)現(xiàn)其同樣可以與Cas9蛋白結合并切割DNA雙鏈。因此，也可以直接將sgRNA同Cas9RNA混合后以顯微注射法導入受體受精卵，大大簡化了繁瑣的操作。

2 CRISPR／Cpf1

CRISPR／Cas技術的發(fā)現(xiàn)，無疑把基因編輯領域的研究帶上了高峰，然而CRISPR／Cas技術也存在著脫靶效應等許多問題，使其至今難以應用于人類基因編輯。研究者繼續(xù)對CRISPR家族進行深度挖掘，進一步發(fā)現(xiàn)了具有更高基因編輯效率的Cpf1蛋白［27］。CRISPR／Cpf1系統(tǒng)根據(jù)其結構和功能被定義為Ⅱ類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)。其Cpf1蛋白為三角型單體，未與crRNA結合時處于較為松散的狀態(tài)，一旦與crRNA結合便顯著改變其構象，從而具有切割目的序列的能力［28］。人們發(fā)現(xiàn)Cpf1蛋白在某些菌中與Cas9蛋白同時存在，但是 CRISPR／Cpf1系統(tǒng)的作用機制與CRISPR／Cas9卻有較大的不同。Cas9來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），而 Cpf1蛋白［29］來自于新兇手弗朗西斯菌（Francisella novicida）、氨基酸球菌（Acidaminococcus）和毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium），其來源更廣泛，且具有更小的分子量，顯示了它在包裝和運輸方面的優(yōu)越性。CRISPR／Cas9系統(tǒng)需要tracrRNA與crRNA結合成RNA二聚體，并經(jīng)過RNaseⅢ加工完善，方可識別目的序列，引導Cas9蛋白進行切割；而CRISPR／Cpf1系統(tǒng)僅需要一段42～44nt的crRNA參與即可，大大減少了實驗的設計與操作流程，降低了實驗的成本與風險。此外，兩個系統(tǒng)均依靠 PAM序列對目的序列進行識別，但Cpf1識別 5′端的 TTN序列，Cas9識別 3′端的NGG序列。Cpf1蛋白剪切位點離PAM序列較遠，有更多的位點供選擇編輯；同時NHEJ修復時不會改變PAM臨近序列，Cpf1蛋白可以再次識別與切割靶序列，提高了基因編輯的效率。而且CRISPR／Cpf1系統(tǒng)切割后留下粘性末端，提高了外源基因的整合效率，這在同源重組率較低的實驗對象中有更大的意義。

圖1 化膿鏈球菌CRISPR／Cas9系統(tǒng)結構及作用機制［26］Fig．1 Structure and mechanism of CRISPR／Cas9 system of Streptococcus pyogenes CRISPR／Cas9

圖2 CRISPR／Cas9及 CRISPR／Cp f1系統(tǒng)示意圖［30］Fig．2 CRISPR／Cas9 and CRISPR／Cpf1 system

盡管CRISPR／Cpf1技術于2015年才發(fā)現(xiàn)，但其目前已經(jīng)在大腸桿菌（Escherichia coli）、小鼠、果蠅（Drosophila melahogaster）等多種模式生物中實現(xiàn)基因編輯，并且成果顯著。HU等［31］于2017年初成功實現(xiàn)了LbCpf1對水稻基因組的編輯，發(fā)現(xiàn)突變率與靶基因有一定關系，而AsCpf1并不能運用于水稻編輯。2017年4月，WANG等［32］用CRISPR／Cpf1技術對水稻的編輯得出了相類似的結論，同時發(fā)現(xiàn)FnCpf1也可用于水稻的編輯，但效率比LbCpf1低。CRISPR／Cpf1技術還有一個重要的優(yōu)勢是脫靶率低。2016年，有兩項研究［33－34］對 CRISPR／Cpf1技術在人體中編輯時的脫靶率做了評估，結果都表明 LbCpf1和AsCpf1在人體基因組上的潛在脫靶位點比Cas9編輯時更少，且脫靶位點的基因突變頻率也低于1%，遠低于靶位點的突變頻率。

CRISPR／Cpf1技術在某些方面比 CRISPR／Cas9更具優(yōu)勢，也取得了許多相關成就，但其研究還不夠深入，實際應用比較少，目前期待更多的科研工作者將其發(fā)掘改造，使其成為更適合于生物體基因編輯的工具。

3 基因編輯技術的比較

ZFNs、TALENs和 CRISPR／Cas9技術都可以進行基因編輯。理論上，ZFNs可以針對任何序列編輯，但其需要構建龐大的鋅指表達文庫，成本昂貴，且脫靶率很高，容易產(chǎn)生細胞毒性，使其應用受到限制。TALENs技術比ZFNs有所改進，但是構建周期長，成本較高，且識別位點受到胸腺嘧啶的制約，難以進行多靶點編輯。CRISPR／Cas9技術設計簡單，成本低廉，構建周期短，可以進行多靶點編輯且靶向修飾效率高，但仍存在脫靶率不確定等問題。

4 CRISPR技術在水生生物中的應用

4．1 模式生物與疾病模型的構建

傳統(tǒng)模式生物的構建依賴于ES細胞，而新型基因編輯技術的出現(xiàn)打破了這一局限，高效簡潔的新技術甚至可以重新定義新的模式生物。斑馬魚因為其形體小巧透明，體外受精，發(fā)育迅速，成本低廉，而且其疾病生理與基因組與人類相似度高，主要信號同通路與基因具有高同源性，逐步成為僅次于小鼠的第二優(yōu)先模式脊椎動物。現(xiàn)在有很多的科學家運用CRISPR／Cas9技術編輯改造斑馬魚基因，并且成功獲得了一批基因缺失的疾病模型。比如，將斑馬魚lncRNA基因啟動子敲除可以探究lncRNA基因對斑馬魚的調(diào)控，對于人類腫瘤研究具有很好的借鑒價值［35］。此外還有UROD基因敲除的人類卟啉癥斑馬魚疾病模型和血紅蛋白hae3基因缺失的斑馬魚模型［36］等。斑馬魚器官都具有強大的恢復能力，如果可以將基因編輯技術運用于此，以解析其再生能力的調(diào)控機制，甚至找到關鍵基因，無疑將成為人類器官疾病患者的福音。玻璃海鞘（Ciona intestinalis）也被視作一種海洋模式生物，目前建立的Hox基因變異與ebf基因缺失的玻璃海鞘模型，主要用于探究脊索動物身體形成的分子機制［37－38］。此外，科研工作者還建立藻類［39］等眾多海洋生物模型，以此探究海洋生物的起源與進化路程，促進了海洋生命的探索與發(fā)現(xiàn)。

4．2 基因功能的解析與篩選

對未知基因的功能進行探索是了解生命的必要進程，但運用傳統(tǒng)技術解析基因功能艱難而又緩慢，無法滿足當今科學探索的需求。CRISPR／Cas9技術的高效切割、精確修飾使其成為基因功能解析的先進工具。許多科研工作者嘗試運用CRISPR／Cas9技術對生長發(fā)育相關基因進行驗證。他們發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚的RFX6基因敲除后，其純和突變體生長緩慢且無法繁育后代，證實了RFX6基因對斑馬魚胰腺發(fā)育的重要性［40］；敲除尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的dmrt1和Foxl2基因，其精巢與卵母細胞生長被抑制，驗證了dmrt1和Foxl2基因對羅非魚發(fā)育的作用［41］；運用 CRISPR／Cas9技術切除熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）six3基因，得到了six3基因參與爪蟾眼睛和大腦形成的結論［42］。隨后，有科研工作者對熒光顯色基因進行了研究，他們利用CRISPR技術敲除?？∟ematostella vectehsis）的NvFP-7R基因，得到不能發(fā)出紅色熒光的變異體?？?；又利用 CRISPR技術為大西洋角螺（Crepidula forhicata）添加了一段編碼熒光蛋白的序列，得到了可以檢測到熒光蛋白的大西洋角螺的幼 體［43－44］。針 對某些基因 的 比 較 研究，MARTIN［45］、孫曉晴［46］分析了不同甲殼動物的Hox基因，探究了其對于生物多態(tài)性的功能的異同。LIN等［47］則對太平洋海膽（Strongylocentrotus purpuratus）的眾多節(jié)點基因進行了比較篩選。科研工作者們除了對小片度的未知基因進行解鎖外，還在一條染色體上設計一對Cas9蛋白位點，實現(xiàn)了至多百萬堿基的大片段切割［48］。在同一條染色體上，利用CRISPR／Cas9技術敲除大片段往往有更高的效率，有利于對基因功能的探索。

4．3 水生生物經(jīng)濟新品種的選育

海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，尤其是魚蝦貝蟹，與人們的生活生產(chǎn)息息相關，而培育優(yōu)質(zhì)品種是促進海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要方法之一。運用新型基因編輯技術顯著地縮短了育種時間，通過目的基因的切除與導入，培育了一大批優(yōu)秀的轉基因海產(chǎn)品。新型基因編輯技術不僅可以敲除基因，還可以高效、定向地導入目的基因，這項技術運用于新品種的選育，較之傳統(tǒng)的轉基因技術更加安全。這些新品種具有較快的生長速度，強大的環(huán)境適應性，創(chuàng)造了巨大的財富。目前，新型基因編輯技術在海淡水經(jīng)濟品種中的應用主要還在實驗階段，較為成功的有淺膚色的新品種大西洋鮭 （Salmo salar）［49］、青鳉 （Oryzias latipes latipes）［50］等。此外，有團隊利用 CRISPR／Cas9技術編輯了脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）幾丁質(zhì)酶相關基因，并計劃對更多的基因進行改造，以期獲得更高產(chǎn)率的新品種［51］。這些都是目前很少的關于CRISPR應用于海洋經(jīng)濟品種的報告，都為水生生物經(jīng)濟新品種的選育提供了思路與參考。

受到“雙肌?！钡膯l(fā)，人們培養(yǎng)了一批肌肉生長抑制素基因缺失或替換的不同品種魚，這些魚大多具有高肌肉、低脂肪的特性，有望成為具有較高培育價值的新品種。除此之外，還可以改造基因獲得一些觀賞性品種，比如觀賞魚蝦等。

4．4 水生生物疾病調(diào)控

除了高產(chǎn)量、高品質(zhì)的新品種研發(fā)，還可以從疾病控制方面考慮，篩選出一批抗病、適應性強的新品種。許多疾病都與基因有關，目前已經(jīng)證明CRISPR／Cas9技術可以用于識別疾病相關基因的關鍵調(diào)控元件［52］，這項技術運用于水生生物，可以探究其疾病發(fā)生原理，控制疾病的爆發(fā)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，病毒性疾病一旦爆發(fā)，難以抑制，往往造成重大經(jīng)濟損失，CRISPR可以記憶并識別外源入侵DNA［24］，可以以此獲得免疫DNA病毒的生物體。白斑綜合征一直是蝦類養(yǎng)殖減產(chǎn)的最重要因素之一，將白斑綜合征病毒基因的特異sgRNA和Cas9蛋白的編碼序列整合到蝦基因中，有望獲得免疫白斑病毒的新品種蝦。

4．5 海洋藥物研發(fā)

海洋生物可以分泌許多具有不同生物活性的物質(zhì)，其中相當一部分都有重要的藥用價值，是具有理想療效的抗腫瘤、抗病毒、抗菌藥物，但其含量甚微，價格昂貴，不能滿足大多數(shù)疾病患者的需求。將這些稀有昂貴的藥物基因轉入特殊載體或者產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖生物中表達，不僅可以獲得藥物，而且可以提升產(chǎn)量，解決了藥物不足，價格昂貴等問題。已有科研工作者嘗試將相關基因提取出來，運用CRISPR／Cas9技術導入海藻等超大規(guī)模養(yǎng)殖生物，或獲得指定類型的斑馬魚胚胎和幼苗進行了小分子藥物篩選，以解決部分海洋藥源問題［53］。在海洋新藥研發(fā)過程中，最重要的是藥物與靶點之間的驗證，而耐藥性突變位點往往與靶點有重要的關聯(lián)，因此可以在野生型背景的細胞中引入耐藥性突變點，以此驗證靶點的可靠性［54］，同時將 CRISPR／Cas9技術與全基因組測序及耐藥性突變篩選結合，大大提高了靶點驗證的效率［55］。

5 問題與展望

新型基因編輯技術的出現(xiàn)再次激發(fā)了生物研究科技工作者們在基因水平改造生物的研究熱情，但其還遠未盡善盡美。首先，新型基因編輯技術本身還存在技術上不完善的地方，如經(jīng)CRISPR／Cas9基因編輯后的小鼠經(jīng)全基因組檢測表明存在上千個無法控制的預測和控制的突變［56］，即 使 CRISPR／Cpf1 系 統(tǒng) 脫 靶 率 比CRISPR／Cas9低，但也容易產(chǎn)生嵌合體；其次，新型基因編輯技術的應用還受到材料本身的很多限制，如對水生生物的甲殼類生物而言，顯微注射后的卵在孵化成功率上還有待進一步提高［51］。任何技術都是從不完善慢慢走向成熟和完善，我們有理由相信，在眾多科研工作者們開始大量展開新型基因編輯技術應用的過程中，上述問題會逐步得到有效地解決。