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        CRISPR基因編輯技術(shù)研究進展及其在水生生物中的應(yīng)用

        2018-10-26 08:07:08馬杭柯孫金秋徐莞媛閻斌倫
        海洋漁業(yè) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:斑馬魚位點生物

        馬杭柯,孫金秋,徐莞媛,閻斌倫,2,3,4,高 煥,2,3,4

        (1.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室,淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,連云港 222005;2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,連云港 222001;3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院(連云港),連云港 222005;4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺,南京 210014)

        基因編輯技術(shù)是在DNA水平,通過刪除、插入等方式對DNA特定序列進行改造的技術(shù)。在CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)以前,人們主要通過鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc-finger nuclease,ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector,TALENs)來實現(xiàn)編輯基因的功能。鋅指核酸酶和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶都是由特異DNA結(jié)合蛋白與DNA核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域組成。這些核酸酶可以在特定位點對 DNA進行切割,形成雙鏈斷裂(double strand break,DSB),隨后在非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重組(homologous recombination,HR)修復(fù)機制下實現(xiàn)基因編輯[1]。ZFN和TALEN技術(shù)提高了打靶效率,降低了安全風(fēng)險,實現(xiàn)了對基因組的定點編輯。然而,對ZFN和TALEN的結(jié)構(gòu)域進行改造需要花費大量人力物力,成本昂貴,使其應(yīng)用受到很大限制[2]。CRISPR/Cas9的出現(xiàn)很好地解決了上述方法存在的問題,為基因編輯提供了一把精確的手術(shù)刀,可以對目的序列進行更簡便、廉價的編輯[3]。

        目前,CRISPR基因編輯技術(shù)已經(jīng)運用于各類陸生生物,包括對擬南芥(Arabidopsis thaliana)多種細(xì)胞進行突變[4]、利用小鼠(Musmusculus)進行癌癥建模[5]、選育水稻(Oryza sativa)新型品種[6]、改造豬(Sus scrofa)多能干細(xì)胞[7]、治療人類(Homo sapiens)基因疾病[8]等,同時,水生生物中該技術(shù)也開始得到應(yīng)用,如在斑馬魚(Danio rerio)[9]、七鰓鰻(Lampetra japonica)[10]等物種中均已成功實現(xiàn)基因編輯。本文就CRISPR基因編輯技術(shù)目前的研究進展及其在水生生物中的相關(guān)應(yīng)用展開綜述,以期為科研工作者們在水生生物研究中進一步應(yīng)用該技術(shù)提供幫助。

        1 CRISPR/Cas

        1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷程

        CRISPR存在于40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中,是細(xì)菌抵御外界入侵的獲得性免疫系統(tǒng),可以識別、整合并切除外源 DNA[11-13]。早在 1987年,ISHINO等[14]在對大腸桿菌基因組進行研究時,發(fā)現(xiàn)其堿性磷酸酶附近存在串聯(lián)間隔重復(fù)序列。2002年,JANSEN等[15]正式將此種結(jié)構(gòu)定義為 CRISPR。2006年,有 研 究 人 員[16]預(yù) 測CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能。根據(jù)此預(yù)測,BARRANGOU等[11]于2007年首次發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)菌可能利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵。隨后,MARRAFFNI等[17]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。直至2012年,JINEK等[18]利用II型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了DNA特異性位點的雙鏈斷裂,是CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因組定點編輯的開端。由此之后,CRISPR技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于各種物種甚至在人體內(nèi)也進行了基因編輯實驗[19]。

        1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類與結(jié)構(gòu)

        CRISPR/Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的差異可以分為3類[20]:第一類是多個蛋白同crRNA結(jié)合成復(fù)合物,在 PAM(protospacer adjacentmotifis)元件的輔助下,使Cas3蛋白可以精確區(qū)分需要降解的外源DNA與序列完全相同的自身DNA,從而實現(xiàn)對外源DNA的識別與切除;第二類則是在PAM元件的輔助下,由Cas9蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切;第三類不需要PAM參與,主要由Cas10蛋白參與crRNA成熟以及對外源DNA的識別與剪切。其中第二類CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌中,但相比于其它類型的復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合體,其只需要Cas9蛋白參與,結(jié)構(gòu)與操作更加簡潔,是目前主要運用的類型。

        以第二類型為例(圖1),其CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括 5′端 tracrRNA(trans-activating crRNA),一系列Cas蛋白編碼基因,以及3′端的CRISPR基因。其中5′端tracrRNA可以與crRNA形成復(fù)合物,幫助 Cas9蛋白識別并切割外源DNA。3′端的CRISPR基因位點其序列由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成[21]。前導(dǎo)區(qū)一般處于CRISPR位點上游,通常由300~500 bp堿基組成,富含AT堿基。此區(qū)域在同種內(nèi)高度保守,但是種間差別較大。余下部分則由多段25~50 bp長度的高度保守的重復(fù)序列和26~72 bp長度的間隔片段互相串聯(lián)而成[22]。在一個CRISPR位點中,重復(fù)序列是高度保守的,5′端和3′端 部 分 尤 為 保 守,分 別 為 GTTT/g和GAAAC[23],而間隔區(qū)卻幾乎沒有相似的序列存在,可能因為它是對不同病毒DNA整合后留下的殘余,作用是獲得對不同病毒的免疫記憶能力。

        1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機制

        同樣以第二類型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例(圖1),其作用主要分為3個階段,分別是新的間隔序列的獲得、crRNA的成熟以及Cas9蛋白對外源DNA的切割。第一階段也可以理解為適應(yīng),即噬菌體或質(zhì)粒第一次侵染時,其一小段DNA序列會被Cas1和Cas2蛋白整合到CRISPR位點的前導(dǎo)區(qū)和第一個重復(fù)序列之間,并重新復(fù)制一個重復(fù)序列,形成新的重復(fù)-間隔單元,從而保存了外源DNA的序列信息,為適應(yīng)性免疫奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)同類噬菌體再次進入有適應(yīng)性的細(xì)菌時,重復(fù)序列會截取和保留入侵噬菌體的某些DNA形成間隔序列,隨后轉(zhuǎn)錄成前體crRNA,經(jīng)Cas蛋白切割成成熟crRNA(包含一個間隔序列和部分重復(fù)序列)后與 tracrRNA形成雙鏈二級結(jié)構(gòu)[24-25]并吸引Cas9蛋白形成復(fù)合體,隨后在PAM序列的幫助下,即可使靶DNA序列中PAM下游3 bp處的雙鏈均斷裂。

        因此,由以上機制引導(dǎo),只需要人工合成特異性crRNA并將其成功轉(zhuǎn)入合適的質(zhì)粒中,與表達tracrRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒共侵染細(xì)胞,就可以得到特異性基因敲除的細(xì)胞系或者動物模型。為了操作更加簡便,JINEK等[18]以一段更加簡單的單鏈引導(dǎo) RNA(sgRNA)替代 crRNA和tracrRNA組成的雙鏈RNA復(fù)合體,發(fā)現(xiàn)其同樣可以與Cas9蛋白結(jié)合并切割DNA雙鏈。因此,也可以直接將sgRNA同Cas9RNA混合后以顯微注射法導(dǎo)入受體受精卵,大大簡化了繁瑣的操作。

        2 CRISPR/Cpf1

        CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)現(xiàn),無疑把基因編輯領(lǐng)域的研究帶上了高峰,然而CRISPR/Cas技術(shù)也存在著脫靶效應(yīng)等許多問題,使其至今難以應(yīng)用于人類基因編輯。研究者繼續(xù)對CRISPR家族進行深度挖掘,進一步發(fā)現(xiàn)了具有更高基因編輯效率的Cpf1蛋白[27]。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能被定義為Ⅱ類Ⅴ型CRISPR系統(tǒng)。其Cpf1蛋白為三角型單體,未與crRNA結(jié)合時處于較為松散的狀態(tài),一旦與crRNA結(jié)合便顯著改變其構(gòu)象,從而具有切割目的序列的能力[28]。人們發(fā)現(xiàn)Cpf1蛋白在某些菌中與Cas9蛋白同時存在,但是 CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的作用機制與CRISPR/Cas9卻有較大的不同。Cas9來源于化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes),而 Cpf1蛋白[29]來自于新兇手弗朗西斯菌(Francisella novicida)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)和毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium),其來源更廣泛,且具有更小的分子量,顯示了它在包裝和運輸方面的優(yōu)越性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要tracrRNA與crRNA結(jié)合成RNA二聚體,并經(jīng)過RNaseⅢ加工完善,方可識別目的序列,引導(dǎo)Cas9蛋白進行切割;而CRISPR/Cpf1系統(tǒng)僅需要一段42~44nt的crRNA參與即可,大大減少了實驗的設(shè)計與操作流程,降低了實驗的成本與風(fēng)險。此外,兩個系統(tǒng)均依靠 PAM序列對目的序列進行識別,但Cpf1識別 5′端的 TTN序列,Cas9識別 3′端的NGG序列。Cpf1蛋白剪切位點離PAM序列較遠(yuǎn),有更多的位點供選擇編輯;同時NHEJ修復(fù)時不會改變PAM臨近序列,Cpf1蛋白可以再次識別與切割靶序列,提高了基因編輯的效率。而且CRISPR/Cpf1系統(tǒng)切割后留下粘性末端,提高了外源基因的整合效率,這在同源重組率較低的實驗對象中有更大的意義。

        圖1 化膿鏈球菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及作用機制[26]Fig.1 Structure and mechanism of CRISPR/Cas9 system of Streptococcus pyogenes CRISPR/Cas9

        圖2 CRISPR/Cas9及 CRISPR/Cp f1系統(tǒng)示意圖[30]Fig.2 CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cpf1 system

        盡管CRISPR/Cpf1技術(shù)于2015年才發(fā)現(xiàn),但其目前已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichia coli)、小鼠、果蠅(Drosophila melahogaster)等多種模式生物中實現(xiàn)基因編輯,并且成果顯著。HU等[31]于2017年初成功實現(xiàn)了LbCpf1對水稻基因組的編輯,發(fā)現(xiàn)突變率與靶基因有一定關(guān)系,而AsCpf1并不能運用于水稻編輯。2017年4月,WANG等[32]用CRISPR/Cpf1技術(shù)對水稻的編輯得出了相類似的結(jié)論,同時發(fā)現(xiàn)FnCpf1也可用于水稻的編輯,但效率比LbCpf1低。CRISPR/Cpf1技術(shù)還有一個重要的優(yōu)勢是脫靶率低。2016年,有兩項研究[33-34]對 CRISPR/Cpf1技術(shù)在人體中編輯時的脫靶率做了評估,結(jié)果都表明 LbCpf1和AsCpf1在人體基因組上的潛在脫靶位點比Cas9編輯時更少,且脫靶位點的基因突變頻率也低于1%,遠(yuǎn)低于靶位點的突變頻率。

        CRISPR/Cpf1技術(shù)在某些方面比 CRISPR/Cas9更具優(yōu)勢,也取得了許多相關(guān)成就,但其研究還不夠深入,實際應(yīng)用比較少,目前期待更多的科研工作者將其發(fā)掘改造,使其成為更適合于生物體基因編輯的工具。

        3 基因編輯技術(shù)的比較

        ZFNs、TALENs和 CRISPR/Cas9技術(shù)都可以進行基因編輯。理論上,ZFNs可以針對任何序列編輯,但其需要構(gòu)建龐大的鋅指表達文庫,成本昂貴,且脫靶率很高,容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性,使其應(yīng)用受到限制。TALENs技術(shù)比ZFNs有所改進,但是構(gòu)建周期長,成本較高,且識別位點受到胸腺嘧啶的制約,難以進行多靶點編輯。CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計簡單,成本低廉,構(gòu)建周期短,可以進行多靶點編輯且靶向修飾效率高,但仍存在脫靶率不確定等問題。

        4 CRISPR技術(shù)在水生生物中的應(yīng)用

        4.1 模式生物與疾病模型的構(gòu)建

        傳統(tǒng)模式生物的構(gòu)建依賴于ES細(xì)胞,而新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)打破了這一局限,高效簡潔的新技術(shù)甚至可以重新定義新的模式生物。斑馬魚因為其形體小巧透明,體外受精,發(fā)育迅速,成本低廉,而且其疾病生理與基因組與人類相似度高,主要信號同通路與基因具有高同源性,逐步成為僅次于小鼠的第二優(yōu)先模式脊椎動物。現(xiàn)在有很多的科學(xué)家運用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯改造斑馬魚基因,并且成功獲得了一批基因缺失的疾病模型。比如,將斑馬魚lncRNA基因啟動子敲除可以探究lncRNA基因?qū)Π唏R魚的調(diào)控,對于人類腫瘤研究具有很好的借鑒價值[35]。此外還有UROD基因敲除的人類卟啉癥斑馬魚疾病模型和血紅蛋白hae3基因缺失的斑馬魚模型[36]等。斑馬魚器官都具有強大的恢復(fù)能力,如果可以將基因編輯技術(shù)運用于此,以解析其再生能力的調(diào)控機制,甚至找到關(guān)鍵基因,無疑將成為人類器官疾病患者的福音。玻璃海鞘(Ciona intestinalis)也被視作一種海洋模式生物,目前建立的Hox基因變異與ebf基因缺失的玻璃海鞘模型,主要用于探究脊索動物身體形成的分子機制[37-38]。此外,科研工作者還建立藻類[39]等眾多海洋生物模型,以此探究海洋生物的起源與進化路程,促進了海洋生命的探索與發(fā)現(xiàn)。

        4.2 基因功能的解析與篩選

        對未知基因的功能進行探索是了解生命的必要進程,但運用傳統(tǒng)技術(shù)解析基因功能艱難而又緩慢,無法滿足當(dāng)今科學(xué)探索的需求。CRISPR/Cas9技術(shù)的高效切割、精確修飾使其成為基因功能解析的先進工具。許多科研工作者嘗試運用CRISPR/Cas9技術(shù)對生長發(fā)育相關(guān)基因進行驗證。他們發(fā)現(xiàn),將斑馬魚的RFX6基因敲除后,其純和突變體生長緩慢且無法繁育后代,證實了RFX6基因?qū)Π唏R魚胰腺發(fā)育的重要性[40];敲除尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的dmrt1和Foxl2基因,其精巢與卵母細(xì)胞生長被抑制,驗證了dmrt1和Foxl2基因?qū)α_非魚發(fā)育的作用[41];運用 CRISPR/Cas9技術(shù)切除熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)six3基因,得到了six3基因參與爪蟾眼睛和大腦形成的結(jié)論[42]。隨后,有科研工作者對熒光顯色基因進行了研究,他們利用CRISPR技術(shù)敲除??∟ematostella vectehsis)的NvFP-7R基因,得到不能發(fā)出紅色熒光的變異體??挥掷?CRISPR技術(shù)為大西洋角螺(Crepidula forhicata)添加了一段編碼熒光蛋白的序列,得到了可以檢測到熒光蛋白的大西洋角螺的幼 體[43-44]。針 對某些基因 的 比 較 研究,MARTIN[45]、孫曉晴[46]分析了不同甲殼動物的Hox基因,探究了其對于生物多態(tài)性的功能的異同。LIN等[47]則對太平洋海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的眾多節(jié)點基因進行了比較篩選??蒲泄ぷ髡邆兂藢π∑鹊奈粗蜻M行解鎖外,還在一條染色體上設(shè)計一對Cas9蛋白位點,實現(xiàn)了至多百萬堿基的大片段切割[48]。在同一條染色體上,利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除大片段往往有更高的效率,有利于對基因功能的探索。

        4.3 水生生物經(jīng)濟新品種的選育

        海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),尤其是魚蝦貝蟹,與人們的生活生產(chǎn)息息相關(guān),而培育優(yōu)質(zhì)品種是促進海淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要方法之一。運用新型基因編輯技術(shù)顯著地縮短了育種時間,通過目的基因的切除與導(dǎo)入,培育了一大批優(yōu)秀的轉(zhuǎn)基因海產(chǎn)品。新型基因編輯技術(shù)不僅可以敲除基因,還可以高效、定向地導(dǎo)入目的基因,這項技術(shù)運用于新品種的選育,較之傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加安全。這些新品種具有較快的生長速度,強大的環(huán)境適應(yīng)性,創(chuàng)造了巨大的財富。目前,新型基因編輯技術(shù)在海淡水經(jīng)濟品種中的應(yīng)用主要還在實驗階段,較為成功的有淺膚色的新品種大西洋鮭 (Salmo salar)[49]、青鳉 (Oryzias latipes latipes)[50]等。此外,有團隊利用 CRISPR/Cas9技術(shù)編輯了脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因,并計劃對更多的基因進行改造,以期獲得更高產(chǎn)率的新品種[51]。這些都是目前很少的關(guān)于CRISPR應(yīng)用于海洋經(jīng)濟品種的報告,都為水生生物經(jīng)濟新品種的選育提供了思路與參考。

        受到“雙肌?!钡膯l(fā),人們培養(yǎng)了一批肌肉生長抑制素基因缺失或替換的不同品種魚,這些魚大多具有高肌肉、低脂肪的特性,有望成為具有較高培育價值的新品種。除此之外,還可以改造基因獲得一些觀賞性品種,比如觀賞魚蝦等。

        4.4 水生生物疾病調(diào)控

        除了高產(chǎn)量、高品質(zhì)的新品種研發(fā),還可以從疾病控制方面考慮,篩選出一批抗病、適應(yīng)性強的新品種。許多疾病都與基因有關(guān),目前已經(jīng)證明CRISPR/Cas9技術(shù)可以用于識別疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)控元件[52],這項技術(shù)運用于水生生物,可以探究其疾病發(fā)生原理,控制疾病的爆發(fā)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中,病毒性疾病一旦爆發(fā),難以抑制,往往造成重大經(jīng)濟損失,CRISPR可以記憶并識別外源入侵DNA[24],可以以此獲得免疫DNA病毒的生物體。白斑綜合征一直是蝦類養(yǎng)殖減產(chǎn)的最重要因素之一,將白斑綜合征病毒基因的特異sgRNA和Cas9蛋白的編碼序列整合到蝦基因中,有望獲得免疫白斑病毒的新品種蝦。

        4.5 海洋藥物研發(fā)

        海洋生物可以分泌許多具有不同生物活性的物質(zhì),其中相當(dāng)一部分都有重要的藥用價值,是具有理想療效的抗腫瘤、抗病毒、抗菌藥物,但其含量甚微,價格昂貴,不能滿足大多數(shù)疾病患者的需求。將這些稀有昂貴的藥物基因轉(zhuǎn)入特殊載體或者產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖生物中表達,不僅可以獲得藥物,而且可以提升產(chǎn)量,解決了藥物不足,價格昂貴等問題。已有科研工作者嘗試將相關(guān)基因提取出來,運用CRISPR/Cas9技術(shù)導(dǎo)入海藻等超大規(guī)模養(yǎng)殖生物,或獲得指定類型的斑馬魚胚胎和幼苗進行了小分子藥物篩選,以解決部分海洋藥源問題[53]。在海洋新藥研發(fā)過程中,最重要的是藥物與靶點之間的驗證,而耐藥性突變位點往往與靶點有重要的關(guān)聯(lián),因此可以在野生型背景的細(xì)胞中引入耐藥性突變點,以此驗證靶點的可靠性[54],同時將 CRISPR/Cas9技術(shù)與全基因組測序及耐藥性突變篩選結(jié)合,大大提高了靶點驗證的效率[55]。

        5 問題與展望

        新型基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)再次激發(fā)了生物研究科技工作者們在基因水平改造生物的研究熱情,但其還遠(yuǎn)未盡善盡美。首先,新型基因編輯技術(shù)本身還存在技術(shù)上不完善的地方,如經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯后的小鼠經(jīng)全基因組檢測表明存在上千個無法控制的預(yù)測和控制的突變[56],即 使 CRISPR/Cpf1 系 統(tǒng) 脫 靶 率 比CRISPR/Cas9低,但也容易產(chǎn)生嵌合體;其次,新型基因編輯技術(shù)的應(yīng)用還受到材料本身的很多限制,如對水生生物的甲殼類生物而言,顯微注射后的卵在孵化成功率上還有待進一步提高[51]。任何技術(shù)都是從不完善慢慢走向成熟和完善,我們有理由相信,在眾多科研工作者們開始大量展開新型基因編輯技術(shù)應(yīng)用的過程中,上述問題會逐步得到有效地解決。

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