李云莉，高權(quán)新，齊占會(huì)，岳彥峰，施兆鴻，彭士明，高 陽(yáng)

（1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 510300；3．浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，舟山 316022）

我國(guó)擁有遼闊的海洋面積，沿海灘涂分布十分廣泛，是全球最大的海水養(yǎng)殖國(guó)家，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，品種與產(chǎn)量日益增加，2015年海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到1 875．6×104t，約占世界海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上，是世界上唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國(guó)家［1－2］。近年來，隨著我國(guó)沿海灘涂總量的增加，沿海灘涂成為了發(fā)展現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的最佳區(qū)域［3］。然而，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖事業(yè)的蓬勃發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)給環(huán)境造成了較大的影響，產(chǎn)生了一系列的環(huán)境問題。造成養(yǎng)殖污染的原因主要有：1）抗生素的使用，2）投入水中的餌料，3）養(yǎng)殖生物的代謝物。其中，抗生素的使用不僅對(duì)水體環(huán)境造成污染，而且長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致無法有效治療致病菌引發(fā)的疾病。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗生素能有效的預(yù)防爆發(fā)性疾病的發(fā)生、促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)以及降低一些營(yíng)養(yǎng)成分的需求量從而節(jié)約營(yíng)養(yǎng)成分，但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生攜帶抗性基因的菌株，特別是會(huì)產(chǎn)生具有多重耐藥性的菌株［4］?？股匾坏┻M(jìn)入水生環(huán)境中，整個(gè)水體中的菌落結(jié)構(gòu)將可能發(fā)生改變，這種改變會(huì)使水生菌產(chǎn)生抗生素抗性基因，從而對(duì)抗生素具有耐受性?？股乜剐曰蚩梢栽诟鞣N環(huán)境介質(zhì)（比如土壤、河水、地下水）中進(jìn)行遷移、轉(zhuǎn)化，繼而整合到質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)基因元件［5］，之后再進(jìn)入到微生物環(huán)境中，在細(xì)菌之間利用基因的橫向轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播，使原本沒有抗生素抗性的細(xì)菌獲得耐藥性，整個(gè)過程伴隨著某些菌的減少，甚至消失［6］；另外，具有耐受性的細(xì)菌就會(huì)增加，成為優(yōu)勢(shì)菌，通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)或人體內(nèi)，嚴(yán)重威脅人類健康甚至生命安全。因此，對(duì)養(yǎng)殖密集型水域抗生素抗性細(xì)菌的多樣性進(jìn)行即時(shí)有效地研究分析是十分必要的。

我國(guó)養(yǎng)殖密集水域的底泥是抗生素及其抗性基因的“蓄積池”，其中滋生大量的抗生素抗性細(xì)菌，所以本研究將底泥作為研究對(duì)象，分別在我國(guó)沿海11個(gè)典型養(yǎng)殖密集水域采樣，利用DNA提取試劑盒提取底泥樣品中的DNA并將其純化，之后進(jìn)行高通量測(cè)序分析，通過比較不同養(yǎng)殖區(qū)域底泥在不同的抗生素作用下微生物群落的多樣性特征變化，以期掌握當(dāng)前我國(guó)東部沿海養(yǎng)殖密集水域抗生素抗性菌的生物多樣性情況，為后續(xù)有效開展養(yǎng)殖水域的生態(tài)保護(hù)及可持續(xù)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)于2015年9－10月，從中國(guó)沿海養(yǎng)殖密集水域采集底泥樣品，從北至南分別是大連、唐山、蓬萊、連云港、啟東、象山、寧德、東山、湛江、陵水和美濟(jì)礁等11個(gè)地點(diǎn)。各個(gè)水域的海水養(yǎng)殖品種不盡相同，山東以北主要養(yǎng)殖半滑舌鰨（Cynoglossus robustus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、對(duì)蝦以及海蜇（Rhopilema esculentum）、刺參等；江浙的養(yǎng)殖品種主要是文蛤（Meretrix meretrix）、梭子蟹、對(duì)蝦以及大黃魚（Larimichthys crocea）、黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）等；福建以南主要養(yǎng)殖鮑魚、中國(guó)花鱸（Lateolabrax maculates）以及珍珠龍膽、點(diǎn)籃子魚（Siganus guttatas）等。每片水域隨機(jī)收集10個(gè)底泥樣品。底泥樣品用密封袋封好，－80℃保存?zhèn)溆茫?］。

1．2 抗生素抗性菌的篩選

將各地采集到的底泥樣品分別充分混勻后，每份樣品稱取3 g進(jìn)行平板涂布實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，其配方為：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 15～20 g，水1000 mL，最終pH為7．4。高溫滅菌后，添加到培養(yǎng)基中的抗生素的濃度分別為：鹽酸四環(huán)素10 μg·mL－1，鹽酸土霉素20μg·mL－1，環(huán)丙沙星2 μg·mL－1，恩諾沙星 2μg·mL－1，磺胺嘧啶 50 μg·mL－1，磺胺甲惡唑 100μg·mL－1。涂布后，36℃培養(yǎng)72 h，每組5個(gè)平行。挑選單菌落，分別放入無菌EP管中，并混合。

1．3 抗生素抗性菌的多樣性分析

將經(jīng)抗生素篩選后的細(xì)菌樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，在IlluminaMiSeq平臺(tái)上對(duì)抗生素抗性菌的多樣性進(jìn)行分析。

1．4 生物信息學(xué)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)［8］。然后對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行OTU聚類，利用Greengene數(shù)據(jù)可對(duì)物種進(jìn)行注釋［9］。通過對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性以及物種在各分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，可以得到微生物群落組成［10］，再通過Beta多樣性分析，研究海水養(yǎng)殖水域底泥樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異［11］。

1．5 數(shù)據(jù)分析

利用 Uparse（version 7．1 http：／／qiime．org）軟件平臺(tái)進(jìn)行OTU聚類，采用 RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析；利用Mothur軟件進(jìn)行稀釋曲線分析；利用Shannon指數(shù)圖和Chao指數(shù)圖進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析；利用Qiime生成不同分類水平上的多樣品物種分布圖；利用R語言制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 多樣性分析

多樣性指數(shù)是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，與種類的數(shù)目（即豐富度）和種類中個(gè)體分配上的均勻性有關(guān)。Chao指數(shù)可以反映微生物群落的豐富度，而Shannon指數(shù)可以反映微生物群落的多樣性［12］。通過Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性分析可知，不同養(yǎng)殖區(qū)域中抗生素抗性菌株的豐富度和多樣性存在著較大的差異，見圖1。由Chao指數(shù)圖可知（圖1-a），大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域抗磺胺甲惡唑的細(xì)菌菌群豐富度最高，抗恩諾沙星和環(huán)丙沙星的細(xì)菌群落豐富度較低；總體來看，北方海水養(yǎng)殖區(qū)域的細(xì)菌菌群比南方海水養(yǎng)殖區(qū)域的細(xì)菌菌群豐富度高。由Shannon指數(shù)圖可知（圖1-b），大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域中抗四環(huán)素類和磺胺類抗生素的底泥細(xì)菌群落多樣性高于抗喹諾酮類抗生素的底泥細(xì)菌群落多樣性，其中尤以抗磺胺嘧啶的細(xì)菌群落的多樣性最高。

圖1 不同抗生素作用下各養(yǎng)殖區(qū)域底泥細(xì)菌微生物的豐富度Fig．1 Species richness of bacteria in sediments from different culture areas under different antibiotics

2．2 群落結(jié)構(gòu)分析

由圖2可見，海水養(yǎng)殖的底泥中的主要細(xì)菌菌群包括酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chiamydiae）、綠彎菌門（Chioroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrycomicrobia）以及分類地位不明確和一些稀有的細(xì)菌菌群。其中，在圖2-a中，大部分水域變形菌門占主要優(yōu)勢(shì)，其次是厚壁菌門；變形菌門在南方海水養(yǎng)殖海域所占的優(yōu)勢(shì)大于北方海水養(yǎng)殖水域所占的優(yōu)勢(shì)；采樣點(diǎn)11（美濟(jì)礁）的底泥細(xì)菌菌群幾乎都是變形菌門。在圖2-b中，大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中，厚壁菌門的細(xì)菌群落占主要優(yōu)勢(shì)，其次是變形菌門；采樣點(diǎn)11（美濟(jì)礁）在磺胺甲惡唑的作用下，變形菌門占主要優(yōu)勢(shì)，而在磺胺嘧啶的作用下，厚壁菌門占主要優(yōu)勢(shì)。在圖2-c中，大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中，厚壁菌門的細(xì)菌群落占主要優(yōu)勢(shì)，其次是變形菌門；采樣點(diǎn)11（美濟(jì)礁）在鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素的作用下，底泥細(xì)菌菌群幾乎都是厚壁菌門。

Heatmap圖通過顏色變化可以直接反映二維矩陣或者表格中的數(shù)據(jù)信息，以數(shù)值的大小來定義顏色的深淺，并將高峰度和低豐度的物種分塊聚類，通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣本在分類水平上的群落組成的相似性和差異性［13］。由圖3可見，不同養(yǎng)殖區(qū)域中，各類細(xì)菌菌群的豐度在不同抗生素的作用下具有較大的差異，可見養(yǎng)殖區(qū)域中使用抗生素會(huì)顯著影響菌落結(jié)構(gòu)。，由圖 3-a可知，在 E8、E4、E9（東山、連云港、湛江水域恩諾沙星抗性菌）組皆具有明顯的優(yōu)勢(shì)菌，且優(yōu)勢(shì)菌的種類不同，優(yōu)勢(shì)菌的種類依次減少；而其它組優(yōu)勢(shì)菌的種類和數(shù)量較少；由圖3-b可知，M8（東山水域磺胺甲惡唑抗性菌）、J11（美濟(jì)礁水域磺胺嘧啶抗性菌）、J3（蓬萊水域磺胺嘧啶抗性菌）、M3（蓬萊水域磺胺甲惡唑抗性菌）組皆具有明顯的優(yōu)勢(shì)菌，且優(yōu)勢(shì)菌的種類不同，并依次減少，而其它組則優(yōu)勢(shì)菌的種類和數(shù)量皆較少；由圖3-c可知，在T1（大連水域抗鹽酸土霉素）、T4（連云港水域鹽酸土霉素）、S3（蓬萊水域鹽酸四環(huán)素）、S1（大連水域鹽酸四環(huán)素）組具有種類和數(shù)量較多優(yōu)勢(shì)菌，且優(yōu)勢(shì)菌的種類皆不同，而其它組優(yōu)勢(shì)菌的數(shù)量和種類則較少。

3 討論

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了自然界中抗性菌株的數(shù)量劇增，尤其是抗生素抗性致病菌的出現(xiàn)和傳播，嚴(yán)重危及人和動(dòng)物健康。有報(bào)道指出，在美國(guó)每年有200萬的病例是由抗生素抗性致病菌引發(fā)的，同時(shí)導(dǎo)致14 000人死亡［14］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)［15－16］，大量的抗生素抗性菌株源自水產(chǎn)養(yǎng)殖密集水域。海水養(yǎng)殖密集水域的底泥成了抗性基因的蓄積地，并不斷的通過水環(huán)境中的細(xì)菌載體，向外周環(huán)境散播［17］。我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，抗生素的使用量非常大，尤其是在密集型水域養(yǎng)殖，所以這些水域的菌群結(jié)構(gòu)必然發(fā)生改變，抗生素抗性細(xì)菌的比例也會(huì)隨之升高［12，18］。眾所周知［19］，水生細(xì)菌可以通過移動(dòng)基因元件的水平移動(dòng)而獲得耐藥基因，同時(shí)細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成也在抗生素的自然選擇下發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。然而有關(guān)我國(guó)沿海典型養(yǎng)殖水域抗生素抗性菌株的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

圖2 不同抗生素處理底泥細(xì)菌在門水平的相對(duì)豐度Fig．2 Relative abundance of bacteria in the level of phylum in seawater treated w ith different antibiotics

圖3 不同抗生素處理海水底泥細(xì)菌屬水平菌群分析Fig．3 Bacteria analysis of seawater sediment treated by different antibiotics at the genus level

近年來，隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用量的不斷增加，抗生素的過度使用和處理不當(dāng)引起了人們的廣泛關(guān)注［20］。濫用抗生素導(dǎo)致藥物的生態(tài)釋放，從而使環(huán)境中的細(xì)菌組成向著適應(yīng)抗生素的方向轉(zhuǎn)化［21－22］，抗生素抗性細(xì)菌隨之成為優(yōu)勢(shì)菌群。早期的研究報(bào)道顯示［23－24］，在大海、沿海水域以及海水沉積物中都發(fā)現(xiàn)了抗生素抗性細(xì)菌。在自然條件下，水生環(huán)境是抗生素抗性細(xì)菌的一個(gè)巨大的集聚地［25－26］，越來越多的抗生素抗性菌株在各種水生環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)和鑒定［27－30］。尤其是在養(yǎng)殖密集水域，抗生素通常被混入魚類飼料或是直接加入到養(yǎng)殖水體中，用于預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，從而加速了抗性基因的傳播和抗性菌株的增殖［17］。所以，隨著養(yǎng)殖水域的富營(yíng)養(yǎng)化、生物耗氧的增加以及抗生素的大量使用，細(xì)菌的多樣性必將發(fā)生顯著變化。然而大海的巨大流動(dòng)系統(tǒng)也會(huì)減緩水產(chǎn)養(yǎng)殖的人為影響。因此，對(duì)比分析不同養(yǎng)殖水域細(xì)菌多樣性，可初步了解水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)尤其是抗生素的大量使用對(duì)海洋生物群落的影響。在本研究中，通過Chao和Shannon指數(shù)圖分析可知，在不同的養(yǎng)殖區(qū)域中使用同一種抗生素，底泥的細(xì)菌群落多樣性存在差異；在同一養(yǎng)殖區(qū)域中使用不同的抗生素，底泥的細(xì)菌群落的多樣性也不相同；這說明抗生素的使用顯著改變了細(xì)菌的群落組成，這與S?RUM等［31］的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類抗生素抗性菌在我國(guó)沿海典型水域中均有分布，而且這些抗生素抗性菌的數(shù)量較大，種類較多，在部分水域優(yōu)勢(shì)菌明顯。研究結(jié)果說明這3大類抗生素在我國(guó)海水養(yǎng)殖過程中使用普遍，這與實(shí)地調(diào)查結(jié)果一致。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明抗生素對(duì)水生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有較大的影響，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗性菌株。喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等抗生素都是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗生素，而且有報(bào)道指出這些抗生素的使用可顯著影響水生細(xì)菌的多樣性［32－33］。SHAH等［34］對(duì)智利鮭魚養(yǎng)殖水域底泥進(jìn)行了基因分析，發(fā)現(xiàn)海水養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)抗生素抗性菌株的多樣性影響顯著。大量研究證實(shí)［34－35］，抗生素在養(yǎng)殖水體和淤泥中的殘留量和時(shí)間與抗性基因的含量和抗生素抗性菌株的數(shù)量呈顯著相關(guān)；這些文獻(xiàn)直接或間接指出抗生素對(duì)水生細(xì)菌的多樣性影響較大，本研究的結(jié)果與之相似。

通過細(xì)菌群落門水平分析發(fā)現(xiàn)，本研究選擇的密集養(yǎng)殖水域中變形菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度優(yōu)勢(shì)明顯。以往的研究指出［36－37］，變形菌門和厚壁菌門是河水、海水以及海洋底泥中的主要類群。在我國(guó)渤海和黃海區(qū)域的海水養(yǎng)殖池塘的沉積物中，也發(fā)現(xiàn)主要細(xì)菌群落為變形菌門和厚壁菌門［38］。此外亦有研究指出，海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群中有變形菌門和厚壁菌門［39］。由此可以看出，海水養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)我國(guó)密集養(yǎng)殖水域細(xì)菌在門水平上的影響較小。然而在屬分類水平上，通過對(duì)各樣本進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，添加不同的抗生素會(huì)顯著改變細(xì)菌群落的多樣性和豐富度；添加同一種抗生素，相鄰水域細(xì)菌群落的相似性不高，南、北養(yǎng)殖水域底泥中細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)存在著較大的差異。究其原因，除了在海水養(yǎng)殖過程中抗生素的使用種類和使用量不同外，可能還由不同海水養(yǎng)殖水域在地區(qū)天氣、養(yǎng)殖模式、溫度變化、水產(chǎn)動(dòng)物種類等方面的差異造成［40－41］。

綜上所述，喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類抗生素抗性菌我國(guó)沿海典型水域分布廣泛；在不同的養(yǎng)殖區(qū)域中使用同一種抗生素，底泥的細(xì)菌群落多樣性存在差異；在同一養(yǎng)殖區(qū)域中使用不同的抗生素，底泥的細(xì)菌群落的多樣性也不相同；變形菌門和厚壁菌門是養(yǎng)殖水域的主要門類。研究結(jié)果表明，抗生素的使用對(duì)抗生素抗性菌的豐度具有顯著的影響，所以規(guī)范抗生素的使用和開展相關(guān)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是今后海洋生態(tài)管理的重點(diǎn)。