周光東　鄧尚貴　霍健聰

摘要[目的]建立快速高效的頭足類物種鑒定方法。[方法]以細(xì)胞色素氧化酶亞基 Ⅰ（CO Ⅰ）基因作為該試驗(yàn)的DNA條形碼，分別對冷凍頭足類和頭足類制品的成分來源進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]20份樣品中18份能夠擴(kuò)增出特異性條帶。通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast工具比對和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，10份冷凍頭足類樣品的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，初步鑒定10 份頭足類制品樣品中以柔魚為主，有2個與商品標(biāo)簽不符，2份樣品未能驗(yàn)證。[結(jié)論]DNA條形碼是一項(xiàng)高效便捷的分子鑒定技術(shù)，可有效應(yīng)用于頭足類凍品及其成分相對單一制品的物種鑒定，為市售相關(guān)產(chǎn)品的監(jiān)管提供較好的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞DNA條形碼；物種鑒別；頭足類；CO Ⅰ基因

中圖分類號S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2018）28-0092-04

Identification of Main Economic Cephalopods and Products by DNA Barcoding Based on CO Ⅰ Gene

ZHOU Guangdong，DENG Shanggui，HUO Jiancong（School of Food and Medicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract[Objective]To establish a rapid and efficient method for the identification of cephalopod species.[Method]In this paper，the CO I gene was used as the general DNA barcoding of this test.The composition of the frozen cephalopods and products were identified respectively.[Result]Sepecific strapes were amplified by PCR in 18 out of 20 samples.The identification results of the ten frozen cephalopods were consistent with the morphological identification results，while the ten cephalopod products were mainly squit，and two were inconsistent with the commodity labels，two samples failed to verify.[Conclusion]DNA barcoding is an efficient and convenient molecular identification technology，which can be effectively applied to species identification of cephalopod frozen products and their relative single products，it provides better technical support for the supervision of related products on the market.

Key wordsDNA barcoding；Species identification；Cephalopods；CO I gene

頭足類水產(chǎn)品是一種低脂高蛋白的健康食品，廣受消費(fèi)者的追捧。頭足類種類繁多，由于產(chǎn)地、營養(yǎng)成分和滋味成分的差異，不同的頭足類品種價格差距也十分明顯。相較于普通水產(chǎn)品，頭足類具有價格高、肉質(zhì)相似、口感差別小等特性，其在加工后，一般消費(fèi)者皆無法通過感官對產(chǎn)品的原料來源直接辨別，目前對于頭足類產(chǎn)品也尚未形成成熟的監(jiān)管體制。在價格懸殊、造假便利以及食品來源檢測難度高的背景下，頭足類產(chǎn)品的造假、摻假、標(biāo)簽亂貼成為了可能。

DNA條形碼技術(shù)是近年來發(fā)展較為迅速的分子鑒定技術(shù)之一。DNA條形碼概念由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert提出，是指使用生物體內(nèi)一條能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且序列較短的DNA片段，從而準(zhǔn)確快速鑒定物種的方法[1-2]。DNA條形碼可以理解為一種標(biāo)準(zhǔn)化指紋識別技術(shù)，檢測人員只需將待測物種的標(biāo)準(zhǔn)DNA提取出來，與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，即可準(zhǔn)確有效地判定待測樣品的物種[3]。DNA條形碼在國外是一項(xiàng)較為成熟的物種鑒定技術(shù)，早在2011年美國食品與藥品管理局便正式批準(zhǔn)了該技術(shù)在食品與藥品領(lǐng)域的應(yīng)用。而國內(nèi)相關(guān)技術(shù)的研究較晚，且研究方向主要集中于珍貴藥材等植物方向，有關(guān)水產(chǎn)品的研究尚處于起步階段[2，4]。易嘯等[5]利用CO Ⅰ基因分別對32種對蝦的核苷酸組成、種間及種內(nèi)遺傳距離進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，即便是同一屬內(nèi)形態(tài)學(xué)特征相似且不易區(qū)分的對蝦都能夠通過DNA條形碼得到有效的鑒別，基于CO Ⅰ基因的DNA條形碼技術(shù)在對蝦上取得了較好的應(yīng)用。該研究將CO Ⅰ基因作為頭足類的靶點(diǎn)，篩選通用引物，對頭足類及其制品進(jìn)行物種鑒別，以期建立準(zhǔn)確高效的頭足類鑒定方法，為食品溯源與食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

冷凍頭足類樣品由舟山進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局提供，頭足類制品（丸類、預(yù)包裝類）分別從舟山國際水產(chǎn)城、超市及網(wǎng)上購買，將冷凍頭足類樣品置于-45 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，預(yù)包裝頭足類制品置于常溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇、異戊醇、氯化鈉、氯仿，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ddH2O、2×Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、GelRed核酸染料，上海生工生物工程有限公司；蛋白酶K，德國Merck公司。

1.2儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；NanoPhotometerTM微量核酸蛋白測定儀，德國Implen公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；2720型PCR儀，美國Applied Biosystems公司 ；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理。首先，對采集的樣品進(jìn)行編號，L1～L10皆為形態(tài)完整的冷凍頭足類；Z1～Z10為頭足類制品，其中Z1～Z3為冷凍魷魚圈，Z4～Z6為魷魚絲，Z7為墨魚滑，Z8～Z10為墨魚丸。

將頭足類制品中油脂較高的樣品（魷魚絲等）進(jìn)行脫脂處理。用滅菌手術(shù)剪取5 g樣品并剪碎置于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋30 s后于45 ℃恒溫水浴鍋中，水浴加熱3 h；將離心管10 000 r/min離心5 min后棄上層油脂，加入15 mL 70%乙醇溶液渦旋2 min，10 000 r/min離心5 min，重復(fù)操作2～3次；加入無水乙醇15 mL渦旋2 min，10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，并置于65 ℃恒溫烘箱中烘干，研磨后保存?zhèn)溆肹6]。

1.3.2頭足類及其制品DNA提取。

1.3.2.1頭足類。提取方法采用高鹽法[7]。用滅菌手術(shù)剪取頭足類樣品100 mg于1.5 mL離心管中，加入 400 μL 裂解液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，400 mmol/L NaCl，2% SDS） 后剪碎；加入20 mg/mL蛋白酶K（20 mg/mL）1 μL，加入離心管中，渦旋30 s，充分均勻混合；將離心管插入塑料浮板上，置于60 ℃恒溫水浴鍋中，水浴加熱8～10 h；冷卻至室溫后，加入 300 μL 6 mol/L 飽和NaCl溶液后，渦旋30 s，然后將其置于4 ℃冷凍離心機(jī)中，10 000 r/min 離心30 min；取上清液至新的離心管中，加入等體積（大約620 μL ）的異丙醇，混合均勻， -20 ℃ 冰箱中放置2 h后4 ℃ 冷凍離心機(jī)中以10 000 r/min 離心 5 min；棄上清液，加入70%乙醇溶液1 000 μL，充分混合后放入4 ℃ 冷凍離心機(jī)以10 000 r/min 離心5 min；棄上清液后，將離心管置于65 ℃恒溫烘箱中烘干；加入 60 μL TE溶液，置于-20 ℃冰箱中。

1.3.2.2頭足類制品。取50 mg經(jīng)去油研磨的樣品于1.5 mL離心管中，其余步驟同冷凍頭足類DNA提取方法。

1.3.3DNA純度及濃度測定。

取DNA模板2 μL，以去離子水作為空白對照，使用微量核酸蛋白測定儀測定樣品DNA模板的質(zhì)量濃度及A260/A280。根據(jù)DNA模板實(shí)際濃度稀釋至50～100 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4PCR擴(kuò)增與測序。

參照文獻(xiàn)中的序列，使用針對無脊椎動物的線粒體CO Ⅰ通用引物（表1），對樣品的CO Ⅰ基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]，針對該引物無法擴(kuò)增出特異性條帶的樣品，利用魚類線粒體CO Ⅰ通用引物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：25 μL，2×Taq MasterMix（Dye）12.5 μL，模板DNA 1 μL（<10 ng），正、反向引物各1 μL（0.4 μmol/L），滅菌的雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過混有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行檢測，并將條帶清晰明亮且單一的產(chǎn)物送至上海生工生物工程進(jìn)行正反雙向測序。

1.3.5數(shù)據(jù)處理。

將生物公司反饋的原始數(shù)據(jù)用SeqMea程序去除兩端雜峰和正反向引物序列后進(jìn)行人工拼接，得到長度約為680 bp的CO Ⅰ基因序列，并用GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blast工具進(jìn)行比對，根據(jù)序列相似度對樣品的物種進(jìn)行鑒別，并與商品標(biāo)簽比對，確認(rèn)樣品物種與標(biāo)簽是否一致。待測樣品的多序列比對通過Clustal X進(jìn)行，并利用MEGA 5.0軟件計(jì)算種間與種內(nèi)遺傳距離，利用Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1冷凍頭足類鑒定分析

2.1.1冷凍頭足類CO Ⅰ基因序列擴(kuò)增。通過該研究所用引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段長度大約為680 bp，待測樣品的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上的條帶較為明亮且清晰單一（圖1），說明該通用引物對頭足類的通用性較高，可有效用于頭足類CO Ⅰ基因的擴(kuò)增。

2.1.2冷凍頭足類CO Ⅰ基因測序結(jié)果分析。采集的10個樣品為市場上較常見的冷凍頭足類，由浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，然后利用DNA條形碼技術(shù)對鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，DNA條形碼鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，且CO Ⅰ序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的物種相似度均大于91%（表2）。

通過Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，可對物種序列同源性較高的CO Ⅰ序列進(jìn)行聚類分析，有助于進(jìn)一步確認(rèn)該序列所對應(yīng)的物種，并判斷不同種樣品之間是否能夠被有效區(qū)分。將10份樣品的序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的30條對應(yīng)物種序列構(gòu)建進(jìn)化樹，以1 000次自展分支檢驗(yàn)（Boot-straps test）。由圖2可知，不同屬的頭足類能夠以其所屬的特性相互聚類，并被分為兩大分支，其中柔魚科的太平洋褶柔魚、鳶烏賊、莖柔魚、柔魚相互聚成一個大支，節(jié)點(diǎn)支持率為76%；剩余6種頭足類相互聚為另一個大支。以上10種頭足類均可形成獨(dú)立的分支，說明DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)⒁陨衔锓N準(zhǔn)確鑒別。

2.2頭足類制品鑒定分析

2.2.1頭足類制品CO Ⅰ基因序列擴(kuò)增。

加熱和氧化是導(dǎo)致DNA降解的主要因素[9-10]。魷魚絲相關(guān)制品的焙烤處理?xiàng)l件一般為75～85 ℃，3～5 min；丸類等相關(guān)制品的煮制處理?xiàng)l件一般為80～90 ℃，15～20 min[11-12]。頭足類制品在加工過程中可能會使DNA嚴(yán)重降解。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短時間的加熱不足以破壞頭足類的所有線粒體DNA，而長時間的加熱處理對頭足類的DNA影響較大。

2.2.2頭足類制品CO Ⅰ基因測序結(jié)果分析。在GenBenk數(shù)據(jù)庫中對10個樣品的CO Ⅰ基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明絕大多數(shù)頭足類制品來源與商品標(biāo)簽符合（表3）。其中墨魚類制品來源與標(biāo)簽不符合的情況較為突出，存在將柔魚甚至是魚類作為原料加工的情況；有2份樣品未能成功擴(kuò)增特異性條帶，均為丸類制品，可能是 DNA降解嚴(yán)重或其不含頭足類成分，需要設(shè)計(jì)新的短序列引物進(jìn)行鑒定，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3結(jié)論與討論

該研究選取了冷凍頭足類和頭足類制品兩類樣品進(jìn)行物種鑒定，基于CO Ⅰ基因的DNA條形碼在冷凍頭足類物種鑒定方面得到了良好的效果，大部分樣品能夠達(dá)到鑒定到種的目標(biāo)，而有部分頭足類制品不能夠達(dá)到鑒定的目標(biāo)，具體原因分析如下：①丸類制品在加工過程中需要將頭足類制成肉糜，期間剪切力和氧化作用可能會對DNA造成較大的破壞，且長時間的高溫蒸煮也會對DNA的完整性造成較大的影

響，考慮設(shè)計(jì)短序列引物，利用微條形碼對未能成功鑒定的樣品進(jìn)行進(jìn)一步研究[13]；②能夠利用DNA條形碼鑒定的待測樣品基本都是未經(jīng)加工的冷凍頭足類與魷魚絲等制品，其成分較為單一，而墨魚丸、魷米花等頭足類制品中含有魚肉、雞肉等多種成分，考慮后期設(shè)計(jì)多重引物對其進(jìn)行鑒定；③頭足類制品加工過程中添加了植物油以及食品添加劑等物質(zhì)，樣品預(yù)處理時未能將其完全除去，可能會降低DNA的提取率或抑制PCR反應(yīng)。因此，DNA條形碼技術(shù)在頭足類食品中的應(yīng)用存在一定的局限性，適用于頭足類初加工品或加工條件相對較為溫和、成分單一的頭足類制品。

DNA條形碼技術(shù)在魚、蝦、蟹等漁類資源中的應(yīng)用日趨成熟。Eugenehk等[14]在利用條形碼對91種海產(chǎn)品的檢測中發(fā)現(xiàn)25%的海產(chǎn)品存在商品標(biāo)簽錯誤的現(xiàn)象，并認(rèn)為DNA是一種可將海產(chǎn)品鑒定到種的較為經(jīng)濟(jì)高效的鑒定技術(shù)；Haye等[15]基于DNA條形碼技術(shù)對智利市售螃蟹制品鑒定中發(fā)現(xiàn)其中一種產(chǎn)品與商品標(biāo)簽不符，表明DNA條形碼是一種能夠用于規(guī)范螃蟹制品加工和銷售的技術(shù)。漁類產(chǎn)品DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展得益于DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大，尤其是魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)，早在2014年FISH-BOL數(shù)據(jù)庫便已收錄了多達(dá)10 267種魚類的75 249條。DNA條形碼技術(shù)從分子水平對頭足類進(jìn)行檢測，范圍更為廣泛，鑒定結(jié)果更加精確，將其應(yīng)用于市場上商品標(biāo)簽與實(shí)物不符的頭足類產(chǎn)品是對水產(chǎn)品市場規(guī)范的一項(xiàng)革新。

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