王菊英 張微微 穆景利 張守鋒 曲 玲 王 瑩

國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心 海洋垃圾和微塑料研究中心 大連 116023

大量研究證明，粒徑小于 5 mm 的微塑料在海洋中普遍存在，且由于其粒徑小，可被浮游動物、貝類、魚類、海鳥和哺乳動物等海洋生物攝食并隨食物鏈遷移。自 2004 年 Thompson等[1]首次提出“微塑料”概念以來，微塑料研究快速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計已有 2 000 余名研究人員發(fā)表了 600 余篇微塑料研究論文[2]。作為微塑料研究中最為基礎的環(huán)節(jié)，各種環(huán)境介質(zhì)中微塑料的分析檢測技術成為一個重要的研究方向并得到了長足發(fā)展[3-6]。但是，由于缺乏標準化分析操作方案，導致海洋環(huán)境中微塑料濃度、成分的可靠數(shù)據(jù)匱乏，不同研究間的結(jié)果不可比[3,4,7-9]，甚至不確定[4,10]。

目前，國際上對海洋塑料污染問題的關注逐漸從科學研究層面向?qū)嵸|(zhì)性污染管控和全球治理延伸，海洋塑料污染問題已從單一的環(huán)境問題演變?yōu)榄h(huán)境問題、經(jīng)濟問題和政治問題縱橫交織的復雜問題[11]。在聯(lián)合國《2030年可持續(xù)發(fā)展議程》的可持續(xù)發(fā)展目標（SDGs）框架內(nèi)，減少塑料垃圾的數(shù)量是防治海洋“污染”的重要指標。調(diào)查研究海洋環(huán)境中微塑料，其目的是向社會公眾和決策者揭示微塑料的污染程度，并為給出解決方案提供基礎數(shù)據(jù)和技術支撐（圖 1）。微塑料分析方法的不統(tǒng)一，不僅制約了相關科學問題的回答，也阻礙了塑料污染海洋治理的進程。本文綜述了海洋環(huán)境中微塑料的采樣、預處理、定量分析和定性鑒別等方面的進展，分析了微塑料分析方法發(fā)展所面臨的挑戰(zhàn)，以期為我國標準化微塑料分析方法的建立提供參考。

圖1 采樣分析是表征環(huán)境中微塑料污染程度并給出解決方案的基礎環(huán)節(jié)[12]

圖2 常用的海表微塑料拖網(wǎng)

1 微塑料分析方法的發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 不同環(huán)境介質(zhì)中微塑料樣品的采集

1.1.1 海水

為使采集的樣品具代表性，通常需采集大體積海水樣品。開放水體的微塑料樣品通常采用不同網(wǎng)目的浮游生物網(wǎng)采集（圖 2）。海表漂浮微塑料采用 Manta 網(wǎng)或 Neuston 網(wǎng)采集。Neuston 雙體船（圖 2a）可在風浪較大時使用；Manta 網(wǎng)（圖 2b）最好在風平浪靜水域使用，以防采樣設備在波浪作用下跳動造成損壞[3]，或避免由于設備狀態(tài)不穩(wěn)定造成采集水樣體積不精準。拖網(wǎng)通常以約 2 節(jié)的速度拖曳 15—30 分鐘。網(wǎng)目決定拖網(wǎng)內(nèi)截留的顆粒物粒徑及過濾的水樣體積，已報道的網(wǎng)目在 50—3 000 μm[13]。常用網(wǎng)目孔徑約 300 μm，其優(yōu)勢是能采集大體積水樣，但不能定量采集 ＜ 300 μm 的顆粒物，特別是對具有生物學意義的 ＜ 100 μm 顆粒的代表性是嚴重不足的。小孔徑網(wǎng)目被堵塞風險高，使用網(wǎng)目 ＜ 300 μm 拖網(wǎng)的研究較少。網(wǎng)衣尺寸也會影響過濾水樣體積，通常網(wǎng)衣長 3—4.5 m。此外，也有研究采用大體積樣品的過濾采樣[14,15]、原位過濾采樣[16]。不同的拖網(wǎng)類型、網(wǎng)目尺寸、濾膜孔徑等非標準化采樣操作，以及表征單位不統(tǒng)一等，嚴重阻礙了中上層水體中微塑料濃度的可比性。

1.1.2 沉積物

海灘微塑料調(diào)查通常布設數(shù)個垂直或平行于海岸線的樣帶，或布設正方形樣方采樣，通常將數(shù)個樣品合并，綜合評估目標海灘的微塑料污染。樣品采集量通常為數(shù)百克到數(shù)千克不等[13]。采樣位置的確定目前尚無定論，因為微塑料的分布與海灘的高、低潮線一樣是動態(tài)的，廢棄物聚集的高潮線是主要的采集區(qū)域[17]。一般采樣深度為表層 2.5 cm、3 cm 或 5 cm 不等，但也有文獻報道深達 0.3 m[18,19]。若使用柱狀采樣器，可實現(xiàn)不同深度的采樣，并可確定不同年代的微塑料濃度。不同的研究給出的微塑料濃度單位也各不相同，包括單位采樣面積、單位沉積物重量或體積的微塑料濃度。目前尚無海灘微塑料采樣標準方案，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可比性也不高。歐盟海洋垃圾技術小組（TSML）和美國大氣與海洋局（NOAA）在海灘微塑料采集標準化方面有了一定的進展。

潮下帶沉積物用抓斗取樣器、箱式或柱狀采樣器（包括多管柱狀采樣器）采集，抓斗采樣器會擾亂沉積物，適用于表層（5 cm）沉積物或大體積采樣，而箱式或柱狀采樣器不會對樣品產(chǎn)生干擾，可同時采集表面和不同層次的樣品，但采樣量少。沉積物樣品一般冷凍或干燥后置于暗處儲存，待進一步分析。

圖3 最常見的密度分離（綠環(huán)）和（生物）化學處理（紅環(huán)）方法[2]

表1 不同環(huán)境介質(zhì)中微塑料的預處理和分析鑒別方法[2]

1.2 樣品預處理

由于環(huán)境樣品中通常含有機質(zhì)、藻類、木制品等各種干擾雜質(zhì)，一般無法對微塑料樣品直接進行分析，需要對樣品進行分離提取，即密度分離和生物化學分離（消化）（圖 3）[9,20-24]。對于不同環(huán)境介質(zhì)中的微塑料，采用的預處理方法有所不同（表 1）。值得推薦的是歐盟于 2013 年[25]及 2015 年[9,26-29]制定的《歐洲海域海洋垃圾監(jiān)測指南》（Guidance on monitoring of marine litter in European seas）中的預處理步驟。

一般塑料聚合物密度為 0.8（如硅膠）—1.4 g cm?3（如聚對苯二甲酸乙二醇酯 PET、聚氯乙烯 PVC），而泡沫塑料——發(fā)泡聚苯乙烯（EPS）的密度 （＜ 0.05 g cm?3）則很小。使用高密度的飽和鹽溶液，可將微塑料顆粒從較高密度的基質(zhì)，如沉積物（2.65 g cm?3）中浮選出來。使用的鹽溶液密度越大，可提取的聚合物種類越多。 NaCl 價廉易得且環(huán)保，飽和 NaCl 溶液是常用的密度浮選液[1,14,18,30]，但其密度（～1.3 g cm?3）相對較低，PVC、PET、聚碳酸酯（PC）和聚氨酯（PU）等常見的聚合物不能全部被提取。飽和 ZnCl2和 NaI 溶液密度較大[31]，分別為 1.4 —1.6 g cm?3[31-33]和 1.6—1.8 g cm?3[31,34]，能提高提取高密度塑料組分的效率，因此有建議采用飽和 NaI 或 ZnCl2溶液對微塑料進行分離浮選?；厥章室话憧蛇_ 80%—100%[35]，但對粒徑較小的微塑料回收率不高[32]，多次回收可提高回收率。使用商業(yè)化的“微塑料沉積物分離器”（MPSS），回收率可達 68%—99%[34]、96%—100%[32]和 98%—100%[36]。

提取和凈化的目的是在去除如生物膜、沙子、木材、海洋生物及其殘骸等非塑料物質(zhì)的同時留存微塑料，并避免人為次生微塑料的產(chǎn)生。因此，不建議采用超聲清洗[37]，老化和變脆塑料可能在超聲處理中斷裂，人為生成新的次生微塑料。30% H2O2處理是較為推薦的微塑料凈化方法[2]。此外，常用酸[38,39]、堿[40-42]或酶溶液[43]去除污染物（圖 3）。但聚酰胺、聚甲醛、聚碳酸酯等會與強酸或強堿發(fā)生反應[33,36]，限制了強酸或強堿的適用性。連續(xù)酶消解凈化方法具有良好的應用前景，有研究者成功使用多種酶（如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等）凈化樣品[3]，被認為是在傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）鑒別分析前干擾較小的方法。

圖 4 不同鑒別方法分析的微塑料粒徑

1.3 分析鑒別

1.3.1 目視鑒別

盡管采用目視法對微塑料進行鑒別存在一定爭議[9,10,13]，但由于其具有操作簡單、成本低和無化學危害等優(yōu)點，是目前最常用的微塑料鑒別技術（占所有研究的 79%）[25]（表 1）。目視鑒別是用肉眼直接或在解剖顯微鏡下完成，適合粒徑 ≥ 500 μm 的微塑料鑒別[4,25]（圖 4）。此外，掃描電鏡可鑒別更小的碎片[44,45]，并獲得更詳實的樣品表面信息，但操作復雜和耗時，實用性并不高。

雖然 50% 的目視鑒別是以縮小潛在微塑料范圍為目的，爾后將采用儀器作進一步的鑒別[9,46,47]，但另外 50% 的研究將目視法作為獨立的鑒別方法[49,50]。為避免主觀或人為誤判，已有人建立微塑料的目視檢測操作程序[13,25,50,51]，但僅在 1/4 的研究論文中提及了該操作程序。若按操作程序檢測，粒徑 ≥ 500 μm 微塑料的目視鑒別結(jié)果是可接受；而 ＜ 500 μm 的顆粒的誤判概率非常高，不應使用目視鑒別法。據(jù)報道，目視鑒別的誤差率變化范圍為 20%[52]—70%[13]，并隨著粒徑的減小而有所增加。因此，目視鑒別由于其在精確度和聚合物類型測定方面的限制，不建議作為獨立的鑒別方法，它只能是進一步分析鑒別的輔助工具。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）是當前鑒定微塑料的最佳技術之一，可通過塑料顆粒的特征光譜獲得具體的聚合物信息[13]。粒徑 ≥ 300 μm 的大顆粒可采用常規(guī) FTIR“衰減全反射”（ATR）模式進行檢測，1 min 內(nèi)即可完成分析且精度高；而對于 20—300 μm 范圍內(nèi)的較小顆粒，可采用顯微傅里葉變換紅外光譜法（μ-FTIR）進行分析，μ-FTIR 是目前最常用的微塑料鑒別儀器方法。觀測方式主要有 2 種，即：隨機或主觀選擇碎片的光譜觀察[9,22,23]；可同時測量多個斑點的基于焦平面陣列（FPA）FTIR 成像[20,21,24]，通過組合 FPA 場實現(xiàn)對濾膜上所有微塑料的分析。在參數(shù)設置上，最為常見的光譜分辨率為 8 cm?1，空間分辨率 50—150 μm。此外，通過 FTIR 光譜可以檢測塑料顆粒的氧化程度，獲取樣品的物理化學風化信息，來準確識別風化嚴重的微塑料[53]。FTIR 的優(yōu)點是能夠準確識別塑料類型，不受熒光干擾，還可對濾膜進行自動分析。但目前 FTIR 能識別的最小粒徑為 20 μm，不能檢測環(huán)境中更小的塑料顆粒；此外，對于不透明/黑色的微塑料分析十分困難；樣品中的水分會干擾鑒定，要求觀察的樣品必須徹底干燥處理。

記錄光譜數(shù)據(jù)，然后評估鑒別結(jié)果，這是微塑料分析中最為關鍵的一個步驟。有 2 種常用評估方法：基于參比表格相關振動譜帶的人工解譯[54,55]和與參比譜庫完整譜圖[56-59]進行比較的庫檢索。人工解譯費時且需專業(yè)知識，僅適用于少量樣品的分析。大多數(shù) FTIR 商用軟件可實現(xiàn)與參比譜庫比較的庫檢索功能，有多種不同的算法計算命中質(zhì)量指數(shù)（HQI），基于 HQI 接受或拒絕鑒別結(jié)果[57,60]，定量確定測量樣本與參比譜圖的相似性。

1.3.3 拉曼光譜法

塑料聚合物具有特征拉曼光譜，可通過與參比譜庫比較鑒別聚合物成分。該法可靠性高，近 2 年來顯微拉曼光譜法已成功應用于不同環(huán)境樣品中微塑料的鑒別。比較拉曼和紅外這兩種光譜方法，有研究者認為對于非常小的碎片（粒徑 ≤ 20 μm）特別推薦拉曼光譜法[61]。在參數(shù)設置上，最常見的是 532 nm[61,62]和 785 nm[63,64]激光波長，拉曼位移范圍變化很大，從 200±150 到 3 000±1 000 cm[2]不等。觀測方式有人工選點和光譜成像，但有研究者指出拉曼光譜成像耗時長（可高達 38 h）[61]，其實用性由此受到限制[2]。拉曼光譜也可以與激光掃描共聚焦顯微鏡耦合，在生物組織內(nèi)定位聚合物顆粒，具有亞細胞精度[65]。與 FTIR 類似，庫檢索是一種較為適宜的評估工具。

環(huán)境樣品中的色素、添加劑或污染物可能會產(chǎn)生熒光，如藻類[61]，熒光干擾時不能生成可解譯的拉曼光譜，因此拉曼法不能檢測有熒光的樣品。此外，激光誘導產(chǎn)生的熒光[7,47,61]也是干擾因素，一般而言較低的激發(fā)波長，傳輸?shù)哪芰扛?，產(chǎn)生的信號強，但也會產(chǎn)生高強度的熒光，使用較高的激發(fā)波長（＞ 1 000 nm）可最小化熒光從而降低干擾。但同時激光器的能量較低會導致產(chǎn)生的聚合物樣品信號較低[4]。在微塑料鑒別分析中，需要綜合權(quán)衡熒光抑制和低信號強度，并發(fā)現(xiàn)最佳激發(fā)波長。

FTIR 和拉曼光譜法是互補的技術，拉曼非活性的分子振動是紅外（IR）的活性狀態(tài)，反之亦然，因此這 2 種光譜法可提供關于微塑料樣品的互補信息。

1.3.4 熱分析方法

除了目視鑒別、FTIR和拉曼光譜法外，有研究者采用熱分析方法鑒別微塑料，其中值得注意的是氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）及其所配附件，如：熱裂解（py）附件或萃取-熱脫附（TED）附件。

塑料聚合物熱裂解生成特征熱解圖譜，py-GC/MS 可分析微塑料的化學成分[35]。有研究采用 py-GC/MS 同時分析了 PE、PP、PS、PA、PVC、PMMA 等，并將自制的熱解圖譜庫與商業(yè)譜庫進行了比較[29,66]，但 py-GC/MS 法存在誤判風險，因為不同的聚合物可能產(chǎn)生相似的熱解產(chǎn)物。py-GC/MS 的另一個缺點是允許上機的樣品量小，僅 0.5 mg，不適用于對異質(zhì)或復雜樣品的研究，如土壤、沉積物或生物樣等[67]。每次只能分析 1 個顆粒，不能應用于大規(guī)模采樣和常規(guī)監(jiān)測工作中處理大批量樣品。與 py-GC/MS 相比，TED-GC/MS 可處理的樣品量達 100 mg，其鑒別結(jié)果不受加熱引起的降解影響[67]，該法穩(wěn)定且適用于環(huán)境樣品分析，但其實用性需要進一步的研究和驗證。

熱分析方法與光譜方法存在很大不同。光譜法不會對樣品造成損壞，它們通過激發(fā)特定官能團的振動來表征樣品的信息，但是處理過程耗時較長。py-GC/MS和 TED-GC/MS 則通過待測樣品加熱后的分解產(chǎn)物來鑒別微塑料成分，可以同時識別聚合物類型和添加劑。光譜法與光學顯微鏡耦合，顯微紅外和顯微拉曼還可得到顆粒的大小和數(shù)量信息。但 py-GC/MS 和 TED-GC/MS 法只能得出聚合物的總質(zhì)量分數(shù)，不能得到微塑料的數(shù)量和粒徑分布的信息。

2 微塑料分析方法發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)分析

2.1 環(huán)境樣品的采樣代表性問題

海洋環(huán)境要素呈不同時間尺度的周期性變化（如潮汐、季節(jié)和厄爾尼諾等），或沿生態(tài)梯度呈不同空間尺度的變化（如河口、水深和溫躍層等），在采樣設計時需考慮上述時空變化[12]。但目前微塑料采樣很少考慮環(huán)境要素的季節(jié)變化[68,69]或年際變化，也未考慮小尺度的時空（小時、天；米）變化。比如，海水中微塑料的垂直分布存在隨深度指數(shù)衰減的情況，僅基于表層拖網(wǎng)的評估，可能低估海洋中塑料的真實存量；微塑料夜間采樣會受到浮游動物向表層垂直遷移的影響，導致網(wǎng)獲到大量浮游動物、仔魚等海洋生物，增加了實驗室前處理的困難；采用化學前處理，理論上分析結(jié)果是水體和生物體內(nèi)微塑料的總量，增加了調(diào)查結(jié)果的不確定性。此外，降雨、風浪等物理過程對海表微塑料的分布影響也較大。

由于研究目標不同，采用的方法和技術不同，以及數(shù)據(jù)上報的單位不同等，導致數(shù)據(jù)的質(zhì)量和分辨率均不同，影響了數(shù)據(jù)的可靠性和可比性，也很難將不同時空采集的樣品進行比較[70]。因此，多方倡導建立涵蓋從采樣、樣品預處理到鑒別的海洋環(huán)境樣品中微塑料分析檢測全流程的標準化作業(yè)程序（SOPs）。加強采樣設計的代表性研究，特別是海灘上采集的沉積物樣品。雖然海灘采樣本身不具挑戰(zhàn)，但要選擇適當?shù)牟蓸游恢?，有代表性地描述動態(tài)變化的海灘的塑料污染確實具有挑戰(zhàn)性。TSML[25]建議歐盟成員國首先標準化微塑料監(jiān)測計劃中的海灘采樣方法。

2.2 自動化鑒別技術的應用問題

盡管顯微技術的應用（如 μ-FTIR、μ-Raman）在微塑料鑒別中占越來越主導的地位，但針對大批量樣品的分析存在兩方面的挑戰(zhàn)：① 如何測定所有的顆粒；② 如何評估所有的譜圖。使用 FPA 檢測器，允許多點同時測量，但同時也會產(chǎn)生大量的譜圖，難以處理。使用熒光技術，可預先智能自動選擇感興趣的測點來減少工作量[71]。此外，也有全自動的商業(yè)軟件解決方案，如用于 μ-Raman 測定的 HORIBA ParticleFinder 軟件[72]，實現(xiàn)顆粒物的自動檢測，可在 3 h 內(nèi)分析一個海水樣品中 70%以上的微塑料。但即便如此，在多數(shù)情況下光譜分析的工作量也非常高，迫切需要開發(fā)強大的自動化微塑料鑒別評估工具。盡管已定義了HQI的閾值，但即使較高的HQI，也可能導致錯誤分類[24,73]。因此，有必要開發(fā)更強大的庫檢索算法，并能處理微塑料的風化問題，可將其與參比原始聚合物進行比較。

2.3 空氣中纖維的沾污問題

研究發(fā)現(xiàn)空氣纖維的背景濃度達到了顯著水平，在實驗室空白和環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)了相似數(shù)量的微纖維[15,48]。目前的大多研究為避免沾污，用金屬箔片覆蓋樣品和儀器[15,74]。在實驗結(jié)果中扣除實驗室分析空白或從分析結(jié)果中直接剔除纖維，但若剔除纖維，則意味著研究中忽略了包括合成纖維在內(nèi)的微纖維，使得纖維成了研究盲點。空氣中纖維沾污的相關研究比較少，亟待加強。

2.4 納米微塑料的分析問題

隨著風化塑料碎片越來越小，納米塑料的分析就成為必須解決的問題。關于取樣和預處理，可借鑒金屬納米顆粒方法。但分析則成為一個難題，關鍵的問題在于如何從天然非塑料納米顆粒中區(qū)分合成納米塑料。有研究者嘗試采用紅外原子力顯微鏡（AFM-IR）[75]進行納米塑料的分析，但是由于納米塑料比微塑料更具異質(zhì)性，該系統(tǒng)的適用性尚未得到有效證實[2]。在海水或土壤等真實環(huán)境樣品中，開展納米塑料的檢測研究相當少，與此相反的是生物攝食納米塑料的毒性研究和模型研究正在激增。然而，模擬研究加入的是受控合成熒光納米塑料，用透射電鏡（TEM）即可檢測，但 TEM 檢測是不能提供化學結(jié)構(gòu)的任何信息的，當然模擬研究也不需要結(jié)構(gòu)信息。在納米粒子追蹤分析（NTA）模型研究中證明了次生納米塑料的生成，雖然無法確定納米塑料的化學結(jié)構(gòu)，但發(fā)現(xiàn)納米粒子濃度可高達 1.26×108個/mL，比空白對照高 3 倍[76]。從濃度量級來看，微塑料可使用的“逐個粒子”分析方法，對納米塑料而言是不可能實現(xiàn)的目標。

眾所周知，納米塑料產(chǎn)自大量的中型塑料和微塑料塑料，并且可被生物吸收。迄今，尚不知道如何檢測真實環(huán)境樣品中的納米塑料，因為難以將它們與沒有化學結(jié)構(gòu)信息的天然納米顆粒區(qū)分開。因此，開發(fā)真正的納米塑料分析方法，并打破基于簡單計數(shù)統(tǒng)計的分析檢測概念將是未來最大的挑戰(zhàn)。

3 小結(jié)

每年都會有不同的研究公布估測的目前海洋環(huán)境中微塑料的濃度和分布，而微塑料的量化仍存在諸多尚未解決的問題。標準化操作程序的缺乏加劇了這個問題，例如：一些研究采用目視法鑒別和計數(shù)微塑料；另外一些研究則進行物理/化學分離后計數(shù)微塑料；而其他研究則使用光譜進行鑒別。此外，微塑料在環(huán)境中分布不均勻，這幾乎阻礙了代表性結(jié)論的得出。因此，不僅需要標準化微塑料的鑒別和量化方法，而且也需要解決取樣代表性的問題。

在微塑料研究中，標準化的方法可獲取有效的微塑料數(shù)據(jù)，包括濃度、粒徑分布、聚合物組分，以及在不同的海洋棲息地和海洋生物群中微塑料的分布等；標準化的方法對于保證不同數(shù)據(jù)集的可比性至關重要。此外，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)將作為真實環(huán)境濃度下，微塑料對海洋生物影響的實驗室試驗設計的基礎。因此，標準化對客觀評價全球海洋中微塑料，并評估其潛在影響和風險至關重要。