韓 磊，李鳴皋，周家興，陳宇亮，孫海文

近年來,-Gx加速度作用對于人體重要臟器功能的影響機制及其防護方面的研究日益受到廣大到醫(yī)學工作者的重視。有研究顯示,模擬飛船返回過程中的較高G值水平的水平加速度作用可導致實驗動物重要臟器如腦、心、肺等的損傷性改變[1]。而航母艦載機飛行員駕機在航母上阻攔著艦時,由于攔阻索的阻攔作用,飛行員也將受到水平方向的加速度載荷的作用,其對飛行員的心、肺等重要臟器的影響及其作用機制目前仍不十分清楚,有待于進一步研究。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9及其特異性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)1作為調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)合成與降解的主要酶類,其與肺組織的炎癥損傷、修復與重建過程有著密切的關系[2-4]。然而,既往關于水平加速度作用與MMP9及其抑制劑TIMP1之間關系的研究罕見報道。作者將就-Gx加速度作用對MMP9及TIMP1表達水平的影響進行研究,進而探索-Gx暴露對肺臟結構和功能的影響機制,為下一步艦載機飛行員心、肺功能的評價、訓練與防護技術和標準的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 1月齡的雄性新西蘭家兔20只,購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(2017-0002)。丙酮(滬試10000418),中性樹膠(上海標本模型廠),無水乙醇(振興化工 XK13-011-0036),二甲苯(滬試100234192),Na2HPO4?12H2O(滬試 10020318),NaH2PO4?2H2O(滬試 20040718),檸檬酸(滬試10007118),免疫組化兩步法試劑盒(博士德SV0001 SV0002),隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒 GHP-9050),電子天平(舜宇恒平儀器SOPTOP),電動震蕩儀(大龍MX-E),恒溫磁力攪拌器(新瑞儀器85-2),酸度計(雷磁 PHS-25),顯微鏡(奧林巴斯CX43)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 新西蘭家兔購回后,先于動物房中飼養(yǎng)1周,以使其適應環(huán)境,然后隨機分為對照組和實驗組(-Gx加速度暴露組),每組10只。

1.2.2 -Gx加速度暴露 實驗動物呈坐位垂直固定于座椅上,放置于動物艙中固定好,使動物面朝軌道運行方向。水平加速度作用條件為：加速度作用方向為由胸至背(-Gx),加速度作用峰值3.6 G,加速度作用時間為2 s。每只實驗動物每天暴露20次,2次暴露之間間隔5 min,共計暴露30 d。對照組動物所有固定程序同暴露組,不進行水平加速度暴露。

1.2.3 標本留取 水平加速度暴露結束后,將實驗組和對照組動物靜脈注射空氣處死,迅速留取肺臟組織標本。部分肺組織置于固定液中進行固定,部分肺組織置于凍存管中放入液氮罐中保存。

1.2.4 膠原含量的測定 染色液的配制：天狼猩紅0.1 g,加入飽和100 mL的苦味酸溶液中,制成0.1%苦味酸-天狼猩紅染色液?？辔端?天狼猩紅染色：①實驗組和對照組的每個肺組織選取2張石蠟切片；②切片依次浸入二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；③經(jīng)各級乙醇至水洗：→100%乙醇5 min→95%的乙醇5 min→85%乙醇3 min→75%乙醇2 min→蒸餾水洗1 min；④切片入苦味酸-天狼猩紅染液中,染色1 h以上；⑤蒸餾水沖去多余的染色液,將切片入蘇木精染液中常規(guī)復染；⑥切片依次入95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→無水乙醇(I)5 min→無水乙醇(Ⅱ)5 min；⑦切片依次入二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min；⑧中性樹脂封片,晾干備用。

切片于顯微鏡下觀察,采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)對結果進行分析,經(jīng)標準灰度校正后,在高倍鏡下隨機取5個不重疊的視野計算膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction,CVF),并計算其平均灰度值。其中,CVF＝膠原面積/全視野面積×100%。每個標本2張切片的CVF的平均值作為該樣本膠原容積分數(shù)值。在偏振光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量情況,用圖像分析軟件計算各組樣本Ⅰ/Ⅲ膠原比值。

1.2.5 MMP9和TIMP1含量的測定 ①包埋好的肺組織標本用切片機進行切片,切片厚度為4 μm；②將切片置于烘箱中,60℃條件下烘片1 h；③將烘好的切片依次置于二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)溶液中脫蠟10 min；④將切片依次置于梯度乙醇中進行復水,具體步驟如下：100%乙醇5 min,100%乙醇5 min,95%乙醇5 min,80%乙醇5 min,蒸餾水沖洗5 min；⑤將切片置于0.1 mol/L且pH＝6.0的枸櫞酸液修復液中,沸水浴20 min,停止加熱后自然冷卻20～30 min；⑥切片置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中,于搖床上清洗切片,每次3 min,共3次；⑦切片于雙氧水中孵育20 min；⑧用PBS溶液清洗切片,每次3 min,共3次；⑨血清中封閉1 h；⑩切片晾干后,分別滴加MMP9(1∶500)和TIMP1(1∶500)一抗,于濕盒中 4 ℃下孵育過夜；○11切片置于PBS溶液中,于搖床上清洗切片,每次3 min,共5次；○12切片晾干后滴加二抗于切片上,在室溫條件下孵育1 h；○13于搖床上用PBS溶液搖動清洗切片,每次3 min,共5次,待切片晾干后,滴加二氨基聯(lián)苯胺溶液進行染色,然后用清水沖洗；○14用蘇木素染核5 min,用流水沖洗多余的蘇木素,再置于分化液中分化1 s；○15將切片于流水中沖洗5 min,依次進行梯度乙醇脫水,具體步驟如下：80%乙醇5 min,95%乙醇5 min,100%乙醇5 min,100%乙醇5 min；○16將切片依次入二甲苯(Ⅱ)透明5 min,二甲苯(Ⅰ)透明5 min,用中性樹膠封片,晾干后備用。

在顯微鏡下進行觀察,并對結果進行統(tǒng)計。統(tǒng)計計數(shù)時,對照組和實驗組每只動物隨機選取3張切片,每張切片在高倍鏡下隨機選取10個高倍鏡視野,計數(shù)每個高倍鏡視野內(nèi)的陽性細胞數(shù),將10個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)的均數(shù)作為該切片的染色陽性細胞數(shù),分別計算對照組和實驗組各樣本陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較用獨立樣本t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 -Gx加速度作用對家兔肺組織MMP9含量的影響 MMP9表達陽性的細胞主要表現(xiàn)為細胞漿呈現(xiàn)出棕色或者黃色的染色結果(圖1)。與對照組相比,實驗組動物肺組織MMP9蛋白表達水平顯著增高(P＜0.05,表1),提示水平加速度作用對實驗動物肺組織MMP9的表達有著顯著的影響。

圖1 2組家兔肺組織MMP9表達情況

表1 -Gx加速度對2組家兔肺組織MMP9含量的影響(±s)

表1 -Gx加速度對2組家兔肺組織MMP9含量的影響(±s)

注：對照組比較,?P＜0.05

組別 MMP9對照組(n＝10) 13.7±7.2實驗組(n＝10) 28.3±12.5?

2.2 -Gx加速度作用對家兔肺組織TIMP1含量的影響 TIMP1表達陽性的細胞主要表現(xiàn)為細胞漿呈現(xiàn)出棕色或者黃色的染色結果(圖2)。與對照組相比,實驗組動物肺組織TIMP1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05,表2),提示水平加速度作用對實驗動物肺組織TIMP1的表達有著顯著的影響。

圖2 2組家兔肺組織TIMP1表達情況

表2 -Gx加速度對2組家兔肺組織TIMP1含量的影響(±s)

表2 -Gx加速度對2組家兔肺組織TIMP1含量的影響(±s)

注：對照組比較,?P＜0.05

組別 TIMP1對照組(n＝10) 17.4±10.2實驗組(n＝10) 8.6±5.9?

3 討論

MMPs是細胞外基質(zhì)降解所必需的、鋅離子依賴性的蛋白酶家族,為細胞外基質(zhì)的主要調(diào)控因素,在細胞外基質(zhì)合成與降解的過程中有著非常重要的作用[5-6]。MMP9又稱明膠酶B,可由單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、纖維母細胞等合成和分泌,其在調(diào)控炎癥反應、維持組織的正常結構、組織損傷后的修復及促進多種細胞因子的表達等方面均有著重要意義[7]。對MMP9表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄、酶原的激活及其抑制物TIMP1等幾個方面進行。多種炎性細胞因子,如白細胞介素(interleukin,IL)-1β、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-α、TGF-β1、IL-1α、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等可促進MMP9的表達。研究表明[8-12],作為MMPs中的重要一員,MMP9在細胞外基質(zhì)的重塑中有著重要的作用,在肺間質(zhì)纖維化、肺氣腫、心室重構、動脈粥樣硬化、缺血-再灌注損傷、心力衰竭等多種疾病的病理過程中扮演著關鍵的角色。MMP9可降解細胞外基質(zhì)中的膠原成分,導致細胞外基質(zhì)的退行性變,造成組織細胞排列紊亂、功能障礙。MMP9 還能促進 TNF-α、TGF-β、IL-1β 等炎性細胞因子的表達水平上調(diào),促進心、肺、腎等組織中膠原、纖維粘連蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄,進而使得膠原合成增加和在間質(zhì)的沉積,損害心、肺、腎等臟器功能；而這反過來又會促進MMPs的表達水平上調(diào),形成惡性循環(huán),進一步加重心、肺等組織結構重構和功能的障礙。本研究發(fā)現(xiàn),實驗組動物心臟和肺組織的MMP9蛋白表達水平較對照組顯著增加,這一結果提示一方面水平加速度暴露可導致實驗動物心、肺等臟器MMP9表達水平的增高；另一方面水平加速度所導致的MMP9增高可能與其造成心、肺等臟器損傷的發(fā)生、發(fā)展有關。其機制可能與MMP9水平增高導致心肌間質(zhì)成分改變、膠原含量和比例變化以及炎性因素等有關。

TIMPs是MMPs的內(nèi)源性、特異性、天然性抑制劑。TIMPs與已激活的MMPs呈1∶1結合,與具有生物活性的MMPs非共價結合,與不具有生物活性的MMPs緊密結合呈復合物形式,如此不可逆的結合抑制了MMPs的活性。TIMPs在體內(nèi)分布廣泛,迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TIMPs家族有4種：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。研究表明[13],TIMPs除具有特異性地抑制MMPs外,還具有調(diào)控細胞增殖、凋亡等功能,從而保持體內(nèi)的動態(tài)平衡。不同TIMPs對MMPs家族成員的抑制作用具有特異性。對MMP9有特異性親和力的是TIMP1,TIMP1主要來自于肺泡巨噬細胞及上皮細胞,是所有家族中活性最強的,其主要抑制功能是通過活化MMP9的鋅離子活性中心與氨基酸功能區(qū)的半胱氨酸殘基相結合,從而阻斷MMP9與基底物的結合,減少細胞外基質(zhì)的降解,是體內(nèi)抑制、調(diào)節(jié)MMP9最主要的因素,從而對疾病進展也可以發(fā)揮作用。生理情況下,在細胞基底膜保持完整的前提條件下,MMP9在機體中處于低活性狀態(tài),與TIMP1保持動態(tài)平衡,當受到病理刺激時,導致細胞基底膜代謝紊亂,平衡被打破,出現(xiàn)一系列病理生理反應[14-15]。

本研究中,實驗組動物肺臟TIMP1蛋白的表達水平較對照組明顯降低,而其MMP9表達水平則顯著增高。這一結果提示水平加速度暴露導致的MMP9表達水平增高可能與其作用下TIMP1的表達受到抑制有關。結合在本研究中發(fā)現(xiàn)的水平加速度暴露導致的實驗組動物心臟膠原含量增高和膠原比例變化,提示水平加速度暴露引起的MMP9/TIMP1平衡破壞,從而使得心、肺等臟器細胞間質(zhì)含量和成分改變,可能是加速度載荷對心、肺功能影響的作用機制之一。而關于水平加速度暴露導致實驗動物肺臟MMP9和TIMP1蛋白表達水平改變的具體機制,目前尚不清楚。在下一步研究中,我們將就此繼續(xù)加以探索。