劉東杰，紀(jì) 樂(lè)，劉 凱，陳德喜，吳 剛

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可以導(dǎo)致慢性乙型肝炎、多種肝臟疾病以及肝癌的發(fā)生,抑制HBV生存周期的某些重要環(huán)節(jié)成為控制HBV感染的重要手段[1]。最近有報(bào)道稱HBV可以利用細(xì)胞自噬來(lái)促進(jìn)自身復(fù)制和存活[2-4]。p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)可以對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用[5]。本研究將檢測(cè)過(guò)表達(dá)ASPP2對(duì)HepG2.215細(xì)胞的自噬,以及對(duì)乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和乙型肝炎E抗原(hepatitis Be antigen,HBeAg)表達(dá)的影響,從而揭示ASPP2是否可以通過(guò)抑制自噬來(lái)達(dá)到抗HBV的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2.215細(xì)胞、人ASPP2重組腺病毒(ASPP2 recombinant adenovirus,rAd-ASPP2)、對(duì)照腺病毒(rAd-vector)和GFP-LC3質(zhì)粒來(lái)自北京市肝病研究所陳德喜教授實(shí)驗(yàn)室。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。 抗 LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg14、Beclin-1、p62、β-actin和ASPP2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。HBeAg酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州健侖生物科技有限公司；HBsAg ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧生物科技有限公司。蛋白裂解液試劑盒、蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。脫脂奶粉和RIPA裂解液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理、腺病毒感染HepG2.215細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%青鏈霉素),在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3-MA用無(wú)菌去離子水配置。5 mmol/L的3-MA處理來(lái)抑制HepG2.215細(xì)胞的自噬,無(wú)菌去離子水為對(duì)照。rAd-ASPP2通過(guò)感染HepG2.215細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)ASPP2過(guò)表達(dá),rAd-vector感染作為對(duì)照。

1.2.2 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HBeAg的水平 3-MA處理或rAd-ASPP2感染48 h后收集HepG2.215培養(yǎng)上清,細(xì)胞則用RIPA裂解液裂解,并將培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液保存于-80℃。按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中的HBsAg和HBeAg的水平。

1.2.3 免疫印記檢測(cè) 收集HepG2.215細(xì)胞后用蛋白裂解試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,并用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。提取的總蛋白經(jīng)沸水煮5 min變性,按30 μg/孔加樣。經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分離(10%或15%的分離膠、5%濃縮膠)后,過(guò)夜轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上。1×PBST洗膜后用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h,加入一抗(1∶1 000稀釋)后4℃過(guò)夜孵育。1×PBST洗膜3次、每次5 min,再加入1∶5 000的二抗室溫下孵育1 h。1×PBST洗膜3次,每次20 min。洗膜完成后膜上加上化學(xué)發(fā)光底物并曝光,曝光條帶用凝膠成像系統(tǒng)采集。

1.2.4 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) HepG2.215細(xì)胞消化并鋪于爬片上培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%以上時(shí),用lipo2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,lipo2000與質(zhì)粒比值為 1 μL∶2.5 μg。 轉(zhuǎn)染6 h 后用1×PBS 洗3 次,并繼續(xù)用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè) HepG2.215細(xì)胞用1×PBS洗3次后,加入4%多聚甲醛室溫下靜置10 min后棄去多聚甲醛并用1×PBS洗3次。接著加入1%Triton X-100/PBS,室溫下靜置10 min后棄去Triton X-100/PBS,并用1×PBS洗3次。摳出爬片并用甘油封片。用熒光顯微鏡(Olympus DP71)檢測(cè)綠色LC3-Ⅱ顆粒的表達(dá)。每個(gè)條件下對(duì)500個(gè)細(xì)胞中的LC3-Ⅱ顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 免疫共沉淀檢測(cè) 用蛋白提取試劑盒提取總蛋白后,總蛋白用蛋白A/G PLUS瓊脂糖微球孵育后,接著加入抗ASPP2抗體并在4℃的條件下過(guò)夜孵育。被蛋白A/G瓊脂糖微球拉下的免疫復(fù)合物用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)一步分離后,過(guò)夜轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上。后續(xù)洗膜、一/二抗孵育及曝光檢測(cè)同免疫印記。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad軟件(5.0版),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)ASPP2可明顯抑制HepG2.215細(xì)胞的自噬 免疫印記結(jié)果顯示rAd-ASPP2感染HepG2.215細(xì)胞可導(dǎo)致 ASPP2過(guò)表達(dá)(圖1A)。ASPP2對(duì)細(xì)胞自噬有抑制和促進(jìn)的作用[5-6]。本研究免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示在HepG2.215細(xì)胞中,較之rAd-vector感染,rAd-ASPP2感染可明顯下調(diào)綠色LC3-Ⅱ顆粒的水平(t＝8.578,P＜0.01)(圖1B,圖1C)。免疫印記結(jié)果顯示ASPP2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致LC3-Ⅱ/Ⅰ比例明顯下調(diào)和p62水平明顯上調(diào)(圖1D)。以上結(jié)果表明在HepG2.215細(xì)胞中,ASPP2對(duì)自噬有抑制作用。但是ASPP2對(duì)Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響(圖1D)。因此,在HepG2.215細(xì)胞中ASPP2并非通過(guò)抑制以上自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)抑制自噬。

圖1 ASPP2過(guò)表達(dá)可抑制HepG2.215細(xì)胞的自噬

2.2 ASPP2與Atg14結(jié)合抑制HepG2.215細(xì)胞的自噬 ASPP2通過(guò)與Atg5的結(jié)合來(lái)減少 Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物的形成,這使得自噬體膜延長(zhǎng)被阻斷從而抑制自噬[5]。本研究中,在HepG2.215細(xì)胞中,ASPP2被檢測(cè)到可與Atg14結(jié)合,而與Atg5或Beclin-1之間未檢測(cè)到結(jié)合(圖2A)。免疫共沉淀結(jié)果顯示促進(jìn)ASPP2表達(dá)可明顯增加它與Atg14的結(jié)合和抑制LC3-Ⅱ的表達(dá)；并且ASPP2表達(dá)越多,則它與Atg14的結(jié)合就越多、對(duì)自噬的抑制也越強(qiáng)(圖2B)。最后,HepG2.215細(xì)胞感染rAd-ASPP2后,Atg14與ASPP2的結(jié)合可被檢測(cè)到,但Atg14與Beclin-1的結(jié)合未被檢測(cè)到(圖2C)。Atg14被報(bào)道可與Beclin-1結(jié)合形成復(fù)合物而促進(jìn)自噬體膜形成。因此,該結(jié)果表明ASPP2與Atg14結(jié)合導(dǎo)致Atg14不能與Beclin-1形成復(fù)合物,從而阻斷自噬體膜的形成并最終抑制自噬發(fā)生。

圖2 ASPP2與Atg14結(jié)合抑制HepG2.215細(xì)胞的自噬

2.3 抑制HepG2.215細(xì)胞自噬可明顯降低HBsAg和HBeAg的水平 自噬抑制劑3-MA處理HepG2.215細(xì)胞后,LC3-Ⅱ/Ⅰ比例和p62的水平分別出現(xiàn)明顯的下調(diào)和上調(diào),結(jié)果表明3-MA明顯抑制了自噬(圖3A)。ELISA結(jié)果顯示,較之試劑對(duì)照,3-MA處理導(dǎo)致培養(yǎng)上清中的HBsAg(t＝16.89,P＜0.001)和HBeAg(t＝6.249,P＜0.01)水平明顯下調(diào)(圖 3B,圖3C)。ELISA結(jié)果也顯示,較之試劑對(duì)照,3-MA處理導(dǎo)致 HepG2.215細(xì)胞內(nèi) HBsAg(t＝20.13,P＜0.001)和 HBeAg(t＝15.75,P＜0.001)的水平明顯下調(diào)(圖3D,圖3E)。該結(jié)果表明抑制自噬可抑制HepG2.215細(xì)胞中HBsAg和HBeAg的表達(dá)。

2.4 過(guò)表達(dá)ASPP2可明顯下調(diào)HBsAg和HBeAg的水平 HepG2.215細(xì)胞感染rAd-ASPP2或rAdvector(對(duì)照)后,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,較之 rAdvector感染,rAd-ASPP2感染導(dǎo)致培養(yǎng)上清中的HB-sAg(t＝7.18,P＜0.01)和 HBeAg(t＝4.326,P＜0.05)水平明顯下調(diào)(圖4A,圖4B)。ELISA檢測(cè)結(jié)果也顯示,較之rAd-vector感染,rAd-ASPP2感染導(dǎo)致HepG2.215細(xì)胞中的 HBsAg(t＝15.81,P＜0.001)和 HBeAg(t＝6.306,P＜0.05)水平明顯下調(diào)(圖4C,圖4D)。該結(jié)果表明過(guò)表達(dá)ASPP2可抑制HBsAg和HBeAg的表達(dá)。

圖3 抑制自噬對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

圖4 過(guò)表達(dá)ASPP2對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)的影響

3 討論

ASPP2是p53結(jié)合蛋白家族促凋亡成員,它通過(guò)與p53結(jié)合可促進(jìn)p53對(duì)前凋亡基因的轉(zhuǎn)錄,因此它是一個(gè)抑瘤基因[7]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)ASPP2對(duì)自噬具有抑制和促進(jìn)兩種作用。當(dāng)ASPP2與Atg5結(jié)合后,它會(huì)抑制自噬體膜的延長(zhǎng)而導(dǎo)致自噬的終止[5]。本研究則在小鼠肝癌細(xì)胞系Hep1-6上觀察到ASPP2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)自噬發(fā)生,并且該自噬具有促凋亡作用(自噬性凋亡)[6]。ASPP2誘導(dǎo)自噬性凋亡與其促進(jìn)損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控因子表達(dá)有關(guān),因?yàn)閾p傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控因子具有介導(dǎo)自噬性凋亡的能力[6]。本研究發(fā)現(xiàn)ASPP2過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2.215細(xì)胞的自噬又展現(xiàn)出了抑制作用。雖然其分子機(jī)制還未被闡明,但是在HepG2.215細(xì)胞中ASPP2具有抑制HBV的能力,提示我們,ASPP2具有被開(kāi)發(fā)成治療HBV感染新方法的潛力。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種生命現(xiàn)象。正常生理情況下或應(yīng)激(如營(yíng)養(yǎng)剝奪導(dǎo)致的饑餓)時(shí),胞漿內(nèi)的雙層膜結(jié)構(gòu)(自噬體膜)包裹受損細(xì)胞器或冗余蛋白形成自噬體,自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體,溶酶體內(nèi)的酶和酸性環(huán)境將自噬體包裹的細(xì)胞器或蛋白降解,降解產(chǎn)物被細(xì)胞再利用或用于產(chǎn)能[8]。因此生理情況下的自噬對(duì)細(xì)胞發(fā)揮一種保護(hù)作用,是一種重要的防御機(jī)制[8]。自噬體膜的形成處于自噬的早期階段,其中Atg14和Beclin-1形成復(fù)合物是促進(jìn)自噬體膜形成的關(guān)鍵。在HepG2.215細(xì)胞中,ASPP2與Atg14結(jié)合后可減少Atg14與Becxlin-1的結(jié)合,從而抑制自噬體膜的形成[9]。有研究發(fā)現(xiàn)ASPP2可以與Atg5結(jié)合并抑制自噬體膜的延長(zhǎng)[5]。雖然本研究中,在HepG2.215細(xì)胞中ASPP2未被檢測(cè)到可與Atg5結(jié)合、從而抑制自噬體膜延長(zhǎng),但是以上結(jié)果表明ASPP2對(duì)自噬的抑制效應(yīng)可能主要是通過(guò)抑制自噬體膜來(lái)達(dá)到。

自噬除了發(fā)揮防御功能外,它還具有清除病原體感染的作用[10]。雖然HBV感染會(huì)誘導(dǎo)自噬,但該自噬不但不能促進(jìn)HBV降解,反而病毒會(huì)利用自噬體膜作為自身DNA復(fù)制的場(chǎng)所而增加自身復(fù)制[2-4]。因此越來(lái)越多的文獻(xiàn)認(rèn)為自噬促進(jìn)了HBV在胞內(nèi)的持續(xù)存在,而抑制自噬則有利于對(duì)HBV的清除[10-12]。ASPP2正好具有抑制自噬體膜形成和延長(zhǎng)的作用,并且ASPP2過(guò)表達(dá)也展現(xiàn)出具有抑制HBsAg和HBeAg產(chǎn)生的能力,提示ASPP2可能具有很好的抗HBV能力。到目前為止,ASPP2具有抗HBV能力的研究還未見(jiàn)報(bào)道,今后我們將繼續(xù)研究ASPP2抗HBV的分子機(jī)制。

但是開(kāi)發(fā)基于ASPP2的抗HBV感染的新方法,從理論上講還是會(huì)有阻力,因?yàn)閲?guó)內(nèi)學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)HBV的x蛋白表達(dá)會(huì)促進(jìn)ASPP2基因的甲基化增加從而減少ASPP2的表達(dá)[13]。而ASPP2表達(dá)減少又將會(huì)導(dǎo)致自噬體膜形成和延長(zhǎng)的增加,從而導(dǎo)致HBV復(fù)制增加。因此,ASPP2和HBV之間存在相互制約的關(guān)系,這種相互制約的分子機(jī)制還有待后續(xù)研究來(lái)闡明。

綜上所述,ASPP2過(guò)表達(dá)具有抗HBV的作用,其機(jī)制與ASPP2結(jié)合Atg14而抑制自噬體膜形成有關(guān)。