吳 愚，林佳穎，王未來，劉正蕓，勾 英，張能英，羅 果，王 歡

子宮內(nèi)膜癌是高發(fā)的女性惡性腫瘤之一,其致病因素不明,絕經(jīng)后女性的發(fā)病率較高[1]。早期患者以手術(shù)治療為主,晚期患者采用手術(shù)、放療和化療相結(jié)合的綜合治療手段。手術(shù)治療不但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,且對于年輕的患者而言,手術(shù)切除會降低雌激素,引起絕經(jīng)期癥狀。雖然化療有一定的療效,但由于化療的副作用明顯,很少單獨應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的治療[2]。所以對于子宮內(nèi)膜癌,目前亟待全新的藥物與治療方法。

槲皮素是植物界分布廣泛的多酚類化合物[3]。研究表明,槲皮素抑制腫瘤生長及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用,與它能夠清除氧自由基、抑制癌基因表達、阻止癌細胞的擴散有關(guān)[4-8],而且槲皮素還能在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的同時,減少活性氧自由基的生成,保護正常細胞[9-10]。由于槲皮素難溶于水,吸收困難,所以眾多研究者對其結(jié)構(gòu)進行修飾,以改善槲皮素的溶解性而以利于腫瘤治療[11-12]。殼寡糖是殼聚糖通過降解而形成良好的水溶性產(chǎn)物。殼寡糖含有多種活性官能團[13],能與腫瘤細胞表面的受體連接,打開腫瘤細胞膜,有效運載藥物,發(fā)揮抗腫瘤作用[14-15]。

本研究通過改善槲皮素的結(jié)構(gòu),合成殼寡糖-槲皮素聚合物,研究該聚合物的溶解度及其在體外對子宮內(nèi)膜癌細胞的抗腫瘤作用,為該聚合物用于子宮內(nèi)膜癌的治療提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人子宮內(nèi)膜癌細胞(JEC)、人正常肝細胞(LO2),本實驗室保存。

1.1.2 試劑 殼寡糖由大連中科格萊科生物公司(依托中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所)惠贈；槲皮素(用無水乙醇配制成終濃度0.001 mg/mL)購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、50%戊二醛(用去離子水配制成終濃度1%)均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器 電子掃描顯微鏡(德國Carl Zeiss Jena公司)；紅外光譜儀(德國Bruker Optics公司)；紫外光譜儀(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備殼寡糖-槲皮素聚合物 聚合物制備流程見圖1。

圖1 殼寡糖-槲皮素聚合物制備流程圖

1.2.2 殼寡糖-槲皮素聚合物的鑒定

1.2.2.1 掃描電鏡觀察形貌 取制備的殼寡糖-槲皮素聚合物(簡稱聚合物)0.01 g,干燥后用導(dǎo)電性好的粘合劑粘在金屬樣品臺上,放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50～300 A的金屬膜,在掃描電鏡下觀察,加速電壓5 kV。

1.2.2.2 紅外光譜儀分析 取制備的聚合物0.01 g,將其溶解后,制成KBr窗片,用紅外光譜儀掃描。

1.2.2.3 紫外光譜儀分析 取制備的聚合物按1∶4的體積溶于去離子水中,取4 mL液體加入比色杯中,進行紫外光譜分析。

1.2.3 聚合物實驗溶解性分析 稱量槲皮素0.05 g配成3.33 mg/mL的槲皮素乙醇溶液,并取5 mL的3.33 mg/mL槲皮素乙醇溶液加入5 mL去離子水定容,再與去離子水混合,配制成17.75 mg/L、35.50 mg/L、71.00 mg/L、142.00 mg/L、284.00 mg/L,去離子水為空白對照,依次取0.1 mL加入96孔板中,得槲皮素系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。在373 nm波長處測定一系列溶液的吸光度,并對槲皮素質(zhì)量濃度進行線性回歸,得到方程y＝0.0067x+0.1284(R2＝0.995,x為溶液濃度,y為吸光度)。

取1 mL槲皮素乙醇溶液(3.33 mg/mL)與5 mL去離子水混合,不斷加入1 mL去離子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結(jié)果,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出槲皮素的表觀溶解濃度。

取0.017 mg/mL殼寡糖20 mL與0.001 mg/mL槲皮素5 mL混合,不斷加入1 mL去離子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結(jié)果,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出表觀溶解度。

取聚合物固體加入1 mL去離子水中,再逐漸加入聚合物固體,直至飽和狀態(tài)。每組取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結(jié)果,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出表觀溶解度。

1.2.4 JEC和LO2細胞的培養(yǎng) 將JEC及LO2細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為RPMI1640(含10%胎牛血清),用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.5 聚合物對腫瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響

1.2.5.1 單獨用藥組 分為陰性對照組、陽性藥物(順鉑)對照組以及聚合物組。藥物濃度分別為3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和16.67 mg/L。

1.2.5.2 聯(lián)合用藥組 分組如下：①陰性對照組；②聚合物作用2 h后聯(lián)用順鉑組(J+S)；③順鉑作用2 h后聯(lián)用聚合物組(S+J),用藥濃度為3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和 16.67 mg/L。增殖實驗采用四氮唑藍比色分析法(methythiazolyl-tetrazolium,MTT),在吸收波長490 nm下測定各組細胞的OD值,計算存活率(%)及抑制率(%),存活率(%)＝用藥組OD值/陰性對照組OD值,抑制率(%)＝1-存活率(%)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聚合物的鑒定 掃描電鏡分析顯示：單獨的殼寡糖為球狀(圖2A),單獨的槲皮素為方塊狀(圖2B),磁力攪拌合成的聚合物為不規(guī)則團塊狀(圖2C)。由此可判斷方塊狀的槲皮素被其它物體覆蓋,形成不規(guī)則的形狀。

圖2 掃描電鏡圖

紅外光譜儀掃描結(jié)果：在3 306.81～2 929.44 cm-1波數(shù)、1 632.71～1 028.26 cm-1波數(shù)出現(xiàn)苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的特有吸收峰位(圖3)。

圖3 殼寡糖-槲皮素聚合物紅外光譜圖

紫外光譜儀掃描結(jié)果：聚合物中槲皮素紫外特征吸收峰為363 nm(圖4A),而單獨的槲皮素紫外特征吸收峰為374 nm(圖4B)。它們的最大吸收波長相差11 nm,并且聚合物中的槲皮素發(fā)生藍移,說明產(chǎn)生新的物質(zhì)。

圖4 紫外光譜圖

綜上結(jié)果,可得出殼寡糖已連接上槲皮素。

2.2 聚合物在水中溶解性測定結(jié)果 槲皮素在水中的表觀溶解度低于聚合物在水中的溶解度(P＜0.05),也低于殼寡糖與槲皮素混合物的溶解度(P＜0.05),表 1。

表1 槲皮素及殼寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

表1 槲皮素及殼寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

注：與槲皮素組比較,?P＜0.05

樣 品 表觀溶解度1 2 3平均值(±s)槲皮素 45.63 62.08 45.23 47.65±3.85殼寡糖-槲皮素混合溶液 173.14 144.93 163.79 160.62±14.37?殼寡糖-槲皮素聚合物 276.08 307.23 298.58 293.96±16.08?

2.3 聚合物對腫瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響 MTT結(jié)果顯示：聚合物各個濃度組,對JEC細胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05),但毒性作用不及順鉑(圖5A)；順鉑對LO2細胞的增殖有明顯的抑制作用(P＜0.05),而各濃度組的聚合物對LO2細胞均無抑制作用(P＜0.05,圖5B)。

圖5 聚合物對正常細胞(LO2)和腫瘤細胞(JEC)增殖的影響(單獨用藥)

2.4 聚合物與順鉑的聯(lián)用順序?qū)δ[瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響 MTT結(jié)果顯示,先加順鉑后加聚合物(S+J)除了在濃度為3.33 mg/L未能產(chǎn)生毒性作用(P＞0.05),其余濃度保持著抑制JEC細胞增殖的作用(P＜0.05),但此組未對LO2細胞產(chǎn)生毒性(P＝0.054,圖6A)；先加聚合物后加順鉑(J+S)保持著抑制JEC細胞增殖的作用(P＜0.05),還對LO2細胞增殖產(chǎn)生一定抑制作用(P＜0.05,圖 6B)。

圖6 聚合物對正常細胞(LO2)和腫瘤細胞(JEC)增殖的影響(聯(lián)合用藥)

3 討論

殼寡糖是具有抗真菌和病毒活性的聚糖衍生物[16],過往研究者多選取聚糖作為包封材料,但是聚糖分子量大,水溶性不及殼寡糖[17]。并且,選取聚糖用作包封物合成方法較為復(fù)雜,目的是形成糖-脂質(zhì)-包裹物的脂質(zhì)體[18]。而本研究采取簡化的磁力攪拌,形成糖-包裹物聚合物,以庫倫力、氫鍵及羥醛縮合的三層動力,達到殼寡糖包裹槲皮素的目的。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物,它能調(diào)控細胞信號通路,誘導(dǎo)腫瘤細胞周期停滯,促進凋亡,抑制腫瘤細胞內(nèi)耐藥基因編碼的糖蛋白表達及其活性,逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥作用[19]。本研究通過掃描電鏡下表征、紅外光譜儀測量、紫外光譜儀測量及溶解性分析,不僅證明得到目標(biāo)聚合物,而且目標(biāo)聚合物有良好的親水性。

MTT法測定聚合物對細胞增殖的影響,聚合物單獨使用時,各個濃度組均對JEC細胞產(chǎn)生抑制作用。用于LO2細胞時,在一定濃度下,表現(xiàn)出對LO2細胞的生長促進作用。原因可能是高濃度的聚合物以團聚的方式,造成殼寡糖包裹層過厚,細胞在胞吞聚合物時,釋放槲皮素比較緩慢。聯(lián)合用藥時,先加順鉑后加聚合物、先加聚合物后加順鉑組對JEC及LO2的毒性都低于順鉑單獨用藥組,先加順鉑后加聚合物時,順鉑對JEC和LO2細胞產(chǎn)生抑制作用,后加入的聚合物對順鉑產(chǎn)生干擾作用,可能是聚合物中槲皮素的部分基團與順鉑中的金屬絡(luò)合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),致使抑制JEC的作用低于單獨應(yīng)用的順鉑效果,也導(dǎo)致對LO2細胞未產(chǎn)生明顯的抑制作用。先加聚合物后加順鉑時,聚合物雖然能起到抑制JEC生長和促進LO2細胞生長,阻擋一部分順鉑接觸細胞,屏蔽順鉑發(fā)揮過強的毒性作用,但是這也導(dǎo)致對JEC抑制率降低,而未被細胞吞噬的聚合物,又不能完全釋放槲皮素與順鉑發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致部分順鉑進入正常細胞,發(fā)揮對LO2細胞的抑制作用。

未來,通過包裹材料運載藥物抗腫瘤治療將會成為醫(yī)學(xué)科研的重點發(fā)展方向。包裹聚合物的尺度也將不斷從分子化縮小為納米化,并且靈敏度和準(zhǔn)確度也會提高,腫瘤的治療效果及患者的生存質(zhì)量將會得到改善。本研究初步完成分子化尺度的運載藥物,證明目標(biāo)聚合物抗腫瘤真實有效,后續(xù)將以縮小尺度為目標(biāo),繼續(xù)深入研究。